以形态分析为基础的砷及砷生物代谢过程与产物的表征研究

论文摘要

本文以形态分析技术为主要研究手段,围绕与生物砷代谢相关的三个热点问题包括中药材,干海产品中砷的食用安全性、正常肝细胞与肝癌细胞代谢差异性以及砷生物代谢过程中砷蛋白的主要存在形态展开研究,获得了一系列有意义的结果及新认识。主要研究内容及所得成果总结如下:第一章,对国内外在砷形态分析及砷生物代谢的近期研究及相关研究成果进行了简单的介绍和评述,并在此基础上归纳出与砷生物代谢相关的三个砷的“矛盾”特性;确定了本研究论文的研究重点及主要研究内容。第二章,建立了三价无机砷（AsIII）、五价无机砷（AsV）、二甲基砷酸（DMA）、一甲基砷酸（MMA）、砷甜菜碱（AsB）和砷胆碱（AsC）六种形态砷的分离方法,采用梯度洗脱法使六种不同形态砷在15min内得到较好分离。并用盐酸浸提和超声溶剂提取两种前处理方法对中药材中不同形态砷进行提取,建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）联用技术进行中药材中砷形态分析的方法,并用于6种中药材中砷形态的分析。研究发现中药材中砷主要以无机砷AsV和As III形态存在,此外动物性药材中还存在微量的砷甜菜碱（AsB）。第三章,根据干海产品中不同形态砷的性质不同,采用不同提取剂,建立了丙酮-甲醇-稀盐酸连续提取的方法,并对该方法所采用的各种试剂进行了优化。研究显示该提取方法对干海产品中的各种形态砷具有较高的提取效率,三步总提取效率可达87-115%。在此基础上对不同性质的干海产品中的砷代谢产物进行了分析,并采用高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱（HPLC-TOF-MS）对未知砷代谢产物进行了表征。结果显示,尽管干海产品中含砷量较高,但在动物性干海产品中砷主要以无毒的砷甜菜碱（AsB）形式存在,约占总可提取砷量的62.0-72.7%;而在植物性干海产品中砷主要以毒性较低的砷糖类物质存在,约占总可提取砷量的63.5-92.7%。因此可以推断干海产品的总体毒性较低。第四章,在对比了多种消解方法的基础上,建立了微波消解-电感耦合等离子体质谱法（Microwave digestion-ICP-MS）测定细胞中砷总量的分析方法。此外,本研究还建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）联用技术进行正常人体肝细胞（Chang肝细胞）中砷形态的分析方法。研究发现Chang肝细胞中存在两种无法用已有商业化的砷形态标准表征的砷形态。本工作通过化学合成法制备了这两种砷形态标准,并采用标准加入法确定出该两种未知砷形态分别为一甲基亚砷酸（MMAIII）和一甲基一硫代砷酸（MMTA）。通过对正常肝细胞（Chang肝细胞）和肝癌细胞（QGY-7703肝癌细胞）砷代谢产物的对比发现,肝癌细胞对砷的代谢能力较弱。此外,由于在肝癌细胞中未检测到二甲基砷酸（DMAV）和一甲基一硫代砷酸（MMTA）,因而可推测这两种代谢产物的缺失与肝癌细胞受到抑制有关,并在此研究基础上根据砷甲基化代谢的机理推测了肝癌细胞受到抑制的原因。第五章,采用组分分析法将染砷小鼠肝脏按其不同的物理化学特性分为多个组分分别加以分析。结果显示小鼠肝脏中砷主要以自由态存在,占总砷含量的42.3-72.8%。其次为砷与不可溶蛋白结合态,占总砷含量的18.4-33.4%。砷与可溶性蛋白结合态含量最少,占总砷含量的8.8-24.3%。此外,研究发现多种砷代谢产物均可与小鼠肝脏中的蛋白结合,其中又以二甲基砷-蛋白结合态的含量最高。通过对三价砷化物（AsIII、MMAIII和DMAIII）与五价砷化物（AsV、MMAV和DMAV）与小鼠肝脏蛋白的亲和力强弱关系的对比,发现三价砷化物与蛋白的亲和力约为五价砷蛋白结合率的2倍,结合体内实验结果最终确定出小鼠肝脏内的砷蛋白主要以二甲基亚砷酸与蛋白结合物（DMAIII-protein）形态存在。此外,本研究还发现一（二）硫代砷化物（MMTA,DMDTA）是砷代谢过程中较易出现的代谢产物,而且这类物质是以与其对应的一（二）甲基亚砷酸（MMAIII,DMAIII）为代谢起点。本文以形态分析技术为主要研究手段,较系统地探讨了干海产品和中药材中砷及其化合物的存在形态及分布特点,填补了该方面研究的空白;同时消除了国内外对我国海产品及中药材中砷毒性的猜测与质疑,具有重要的社会效益和经济效益。此外,通过对生物砷代谢过程中砷代谢产物的表征和对比研究,探讨了硫代砷化物的来源,砷对肝癌细胞生长有抑制作用这一现象的化学机理以及小鼠体内砷蛋白的主要存在形态,这些研究结果会为人们更好地理解砷生物代谢过程并利用砷的化合物进行癌症治疗提供相关的分析方法学,科学信息及技术支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1. 元素形态分析的定义及应用
• 2. 砷
• 2.1 自然界中的砷
• 2.2 “矛盾”的砷
• 2.2.1 砷的形态与毒性
• 2.2.2 砷甲基化的“解毒”与“致毒”
• 2.2.3 “致癌”与“治癌”
• 3. 海产品中砷形态分析
• 3.1 海产品中砷的来源及特征
• 3.2 海产品中常见的砷形态
• 3.2.1 AsIII 和AsV
• 3.2.2 一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）
• 3.2.3 砷甜菜碱（AsB）
• 3.2.4 砷胆碱（AsC）
• 3.2.5 砷糖
• 3.2.6 其他砷形态
• 3.3 海产品中砷形态分析的样品前处理技术
• 3.3.1 超声辅助提取
• 3.3.2 快速溶剂提取
• 3.3.3 微波辅助提取
• 3.4 海产品中砷测定技术
• 3.4.1 砷形态分离系统——高效液相色谱（HPLC）
• 3.4.2 HPLC 与ICP-MS 的联用
• 3.4.3 HPLC 与电喷雾质谱（ESI-MS）的联用
• 4. 中药材中的砷形态分析
• 5. 以形态分析为基础的砷生物代谢研究进展
• 5.1 砷的生物代谢
• 5.2 以砷形态分析为基础的砷代谢研究
• 5.2.1 形态分析在砷代谢研究中的作用
• 5.2.2 砷代谢产物的HPlC-ICP-MS 表征
• 5.2.3 硫代砷化物的研究
• 5.2.4 以形态分析为基础的砷代谢研究中的问题与挑战
• 6. 本文创新点及研究意义
• 6.1 本文创新点
• 6.2 科学意义
• 参考文献
• 第二章 中药材中砷形态分析研究
• 1. 引言
• 2. 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 试剂及样品
• 2.2 标准溶液的配制
• 2.3 中药材中砷化学形态的提取方法
• 2.3.1 盐酸浸提（HCL）
• 2.3.2 超声溶剂提取（SON）
• 2.3.3 传统煎煮法浸提（TD）
• 2.4 HPLC-ICP-MS 分析中药材中砷化学形态
• 3. 结果与讨论
• 3.1 色谱分离条件的选择
• 3.1.1 色谱柱的选择
• 3.1.2 洗脱方式的选择
• 3.1.3 流动相的选择
• 3.2 方法的线性范围与检出限
• 3.3 样品提取方法的对比
• 3.4 分析方法准确性考察
• 75ArCl⁺分子质谱干扰'>3.5⁷⁵ArCl⁺分子质谱干扰
• 3.6 实际样品中砷化学形态分析
• 3.6.1 盐酸浸提（HCL）和超声溶剂（SON）提取砷化学形态的比较
• 3.6.2 分析方法稳定性考察
• 3.6.3 砷化学形态分析
• 4. 小结
• 参考文献
• 第三章 干海产品中砷形态研究
• 第一节 动物性干海产品中砷形态连续提取法研究
• 1. 引言
• 2. 实验部分
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 仪器操作参数
• 2.4 标准工作曲线
• 2.5 砷总量的测定
• 2.6 海产品中砷的连续提取法
• 3. 结果与讨论
• 3.1 连续提取法的优化
• 3.2 动物性干海产品中砷的形态分析
• 3.3 测定准确性和回收率
• 4. 小结
• 第二节 干海产品中砷形态分析研究
• 1. 引言
• 2. 实验部分
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 仪器操作参数
• 2.4 样品及样品前处理
• 2.5 干海产品中总砷测定
• 2.6 样品中砷化合物的提取和检测
• 2.6.1 快速溶剂提取（ASE）
• 2.6.2 超声溶剂提取（SON）
• 2.6.3 水煮提取
• 2.6.4 丙酮－甲醇水溶液－盐酸连续提取法
• 3. 结果与讨论
• 3.1 干海产品中总砷测定
• 3.2 干海产品中的砷形态提取
• 3.3 干海产品中砷形态分析
• 3.4 植物性海产品中未知砷化物的表征
• 3.5 干海产品中砷形态的定量和半定量分析
• 4. 小结
• 参考文献
• 第四章 人肝实质细胞中砷及砷代谢产物的分析
• 第一节 人肝实质细胞中总砷测定方法研究
• 1. 引言
• 2. 实验部分
• 2.1 仪器
• 2.2 试剂
• 2.3 细胞染砷培养及收集
• 2.4 样品前处理
• 2.4.1 直接测定法
• 2.4.2 冷消化法
• 2.4.3 高压密闭容器消解法
• 2.4.4 微波消解法
• 2.5 总砷测定
• 2.5.1 标准溶液的配制
• 2.5.2 ICP-MS 测定细胞中的砷总量
• 3. 结果与讨论
• 3.1 不同处理方法砷总量测定对比
• 3.2 干扰及消除
• 3.3 线性范围及精密度
• 3.4 方法检出限及回收率
• 第二节 人肝实质细胞中砷及砷代谢产物的表征
• 1. 引言
• 2. 实验部分
• 2.1 仪器
• 2.2 试剂
• 2.3 砷化物标准的合成与制备
• 2.3.1 一甲基亚砷酸（MMAIII）制备
• 2.3.2 一甲基硫代砷酸（MMTA）的制备
• 2.4 HPLC-ICP-MS 及HPLC-TOF-MS 分析染砷肝细胞中砷化学形态
• 2.4.1 样品处理
• 2.4.2 HPLC-ICP-MS 工作条件
• 2.4.3 ESI-TOF-MS 工作条件
• 3. 结果与讨论
• 3.1 色谱条件的选择及优化
• 3.2 Chang 肝细胞中砷形态分析
• 3.3 一甲基亚砷酸（MMAIII）和一甲基一硫代砷酸（MMTA）的表征
• 3.3.1 MMAIII 和MMTA 的表征
• 3.3.2 加标法分析Chang 肝细胞中的MMAIII 和MMTA
• 3.4 一甲基一硫代砷酸（MMTA）来源的探讨
• 3.5 不同染砷浓度下Chang 肝细胞中砷形态分析
• 3.6 形态分析方法评价
• 第三节 人肝癌细胞中砷代谢产物研究
• 1. 引言
• 2. 实验部分
• 2.1 仪器
• 2.2 试剂
• 2.3 细胞染砷培养及收集
• 2.4 细胞中砷形态分析
• 3. 结果与讨论
• 3.1 肝癌细胞中的砷形态
• 3.2 肝癌细胞与正常肝细胞中砷形态对比分析
• 本章小结
• 参考文献
• 第五章 染砷小鼠肝脏中砷代谢产物分布研究
• 1. 引言
• 2. 实验部分
• 2.1 仪器
• 2.2 试剂
• 2.3 一甲基亚砷酸（MMAIII）和一甲基一硫代砷酸（MMTA）的制备
• 2.4 二甲基亚砷酸（DMAIII）和二甲基二硫代砷酸（DMDTA）的制备
• 2.5 仪器操作参数
• 2.5.1 HPLC-ICP-MS 工作条件
• 2.5.2 HPLC-TOF-MS 工作条件
• 2.6 实验动物与培养
• 2.7 受试动物与染砷
• 2.8 小鼠肝脏不同蛋白组分的提取及分析
• 2.9 体外培养实验
• 3. 结果与讨论
• 3.1 二甲基亚砷酸（DMAIII）和二甲基二硫代砷酸（DMDTA）合成标准的表征
• 3.2 色谱分离条件的适用性
• 3.3 染砷小鼠肝脏中不同组分的砷形态分析
• 3.4 不同价态砷化物与蛋白亲和力研究
• 本章小结
• 参考文献
• 第六章 结论
• 缩略语注释
• 致谢
• 个人简历及在学期间发表的学术论文