本文主要研究内容
作者郑禾（2019）在《蛋白质工程改造的Baeyer-Villiger单加氧酶催化多功能性反应研究》一文中研究指出：Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)作为一种重要的生物催化剂,具有选择性高、反应条件温和、高效等优点,可以催化各种有机酮/醛化合物的Baeyer-Villiger氧化反应,以及一些含硫、硒、硼等杂原子底物的非天然氧化反应。BVMO催化的选择性氧化反应已被广泛应用于各种手性化合物的合成中。近年来,利用生物信息学分析和基因挖掘技术,从众多微生物中找到了多种新型的BVMO;而利用蛋白质工程技术对已知的野生型BVMO进行改造,可以改善酶的立体、区域和化学选择性,扩大底物范围,提高酶的热稳定性和反应活性。随着国内外相关研究的进展,Baeyer-Villiger单加氧酶在有机合成中的应用将进一步得到拓宽。本论文通过对CHMO以及PAMO的蛋白质工程改造,以期提高其催化活性和选择性;并分别用这些突变株催化α-酮酯的还原反应以及硼有机化合物的氧化拆分反应,研究突变结构对2种非天然反应的催化活性和立体选择性的影响。具体研究内容和结果如下:首先,本论文根据CHMO催化Baeyer-Villiger氧化反应的机理,提出了利用CHMO催化循环中黄素的还原态将α-酮酯还原为α-羟基酯的假设,探讨了CHMO催化α-酮酯还原的多功能性反应。在选择苯甲酰甲酸乙酯作为模型底物底物并控制多个反应条件和多个对照实验的情况下,最终验证了CHMO的确具备相应的还原能力。进一步选择了CHMO活性中心附近的8个氨基酸残基进行定向进化,通过筛选后获得了具有优异活性和R构型立体选择性的突变株L143F,其ee值为98%,还获得了立体选择性反转的突变株F277L。继而利用CHMOL143F突变株考察了全细胞状态下,反应温度、诱导剂浓度、pH环境、沉淀菌株等条件对反应的影响。最后,设计了8种拓展底物研究了该还原反应的普适性和底物范围。其次,本论文研究了PAMO催化α-苯乙基频哪醇硼烷的非天然氧化拆分反应。但在全细胞环境中,野生型PAMO的立体选择性很差。定向进化研究发现,PAMO的活性位点Loop上67以及440-446位点与底物的特异性以及空间选择性有密切联系。我们选用野生型PAMO为模板,在上述6个位置进行定向进化,构建单突变文库。通过筛选,最终发现I67Q突变株可将产物立体选择性由野生型的25%(S)提高到72%(S),而S441E突变株实现了产物的优势构型由S逆转为及,产物的ee值为45%。考虑到硫醚类底物与模型底物的相似性,我们选择以突变株4M(167Q/P440F/A442N/L443I)为模板,将 67、440、442、443位点突变为不同大小以及不同酸碱性的氨基酸,进一步探索能实现更高尺构型立体选择性的突变株。最终发现构成4M的4种单突变的产物优势构型都是S构型,而4M突变的优势产物为及构型,进一步验证了杂原子氧化反应机理的相似性,但以4M为模板的其他突变并未获得高立体选择性的筛选结果。
Abstract
Baeyer-Villigerchan jia yang mei (BVMO)zuo wei yi chong chong yao de sheng wu cui hua ji ,ju you shua ze xing gao 、fan ying tiao jian wen he 、gao xiao deng you dian ,ke yi cui hua ge chong you ji tong /quan hua ge wu de Baeyer-Villigeryang hua fan ying ,yi ji yi xie han liu 、xi 、peng deng za yuan zi de wu de fei tian ran yang hua fan ying 。BVMOcui hua de shua ze xing yang hua fan ying yi bei an fan ying yong yu ge chong shou xing hua ge wu de ge cheng zhong 。jin nian lai ,li yong sheng wu xin xi xue fen xi he ji yin wa jue ji shu ,cong zhong duo wei sheng wu zhong zhao dao le duo chong xin xing de BVMO;er li yong dan bai zhi gong cheng ji shu dui yi zhi de ye sheng xing BVMOjin hang gai zao ,ke yi gai shan mei de li ti 、ou yu he hua xue shua ze xing ,kuo da de wu fan wei ,di gao mei de re wen ding xing he fan ying huo xing 。sui zhao guo nei wai xiang guan yan jiu de jin zhan ,Baeyer-Villigerchan jia yang mei zai you ji ge cheng zhong de ying yong jiang jin yi bu de dao ta kuan 。ben lun wen tong guo dui CHMOyi ji PAMOde dan bai zhi gong cheng gai zao ,yi ji di gao ji cui hua huo xing he shua ze xing ;bing fen bie yong zhe xie tu bian zhu cui hua α-tong zhi de hai yuan fan ying yi ji peng you ji hua ge wu de yang hua ca fen fan ying ,yan jiu tu bian jie gou dui 2chong fei tian ran fan ying de cui hua huo xing he li ti shua ze xing de ying xiang 。ju ti yan jiu nei rong he jie guo ru xia :shou xian ,ben lun wen gen ju CHMOcui hua Baeyer-Villigeryang hua fan ying de ji li ,di chu le li yong CHMOcui hua xun huan zhong huang su de hai yuan tai jiang α-tong zhi hai yuan wei α-qiang ji zhi de jia she ,tan tao le CHMOcui hua α-tong zhi hai yuan de duo gong neng xing fan ying 。zai shua ze ben jia xian jia suan yi zhi zuo wei mo xing de wu de wu bing kong zhi duo ge fan ying tiao jian he duo ge dui zhao shi yan de qing kuang xia ,zui zhong yan zheng le CHMOde que ju bei xiang ying de hai yuan neng li 。jin yi bu shua ze le CHMOhuo xing zhong xin fu jin de 8ge an ji suan can ji jin hang ding xiang jin hua ,tong guo shai shua hou huo de le ju you you yi huo xing he Rgou xing li ti shua ze xing de tu bian zhu L143F,ji eezhi wei 98%,hai huo de le li ti shua ze xing fan zhuai de tu bian zhu F277L。ji er li yong CHMOL143Ftu bian zhu kao cha le quan xi bao zhuang tai xia ,fan ying wen du 、you dao ji nong du 、pHhuan jing 、chen dian jun zhu deng tiao jian dui fan ying de ying xiang 。zui hou ,she ji le 8chong ta zhan de wu yan jiu le gai hai yuan fan ying de pu kuo xing he de wu fan wei 。ji ci ,ben lun wen yan jiu le PAMOcui hua α-ben yi ji pin na chun peng wan de fei tian ran yang hua ca fen fan ying 。dan zai quan xi bao huan jing zhong ,ye sheng xing PAMOde li ti shua ze xing hen cha 。ding xiang jin hua yan jiu fa xian ,PAMOde huo xing wei dian Loopshang 67yi ji 440-446wei dian yu de wu de te yi xing yi ji kong jian shua ze xing you mi qie lian ji 。wo men shua yong ye sheng xing PAMOwei mo ban ,zai shang shu 6ge wei zhi jin hang ding xiang jin hua ,gou jian chan tu bian wen ku 。tong guo shai shua ,zui zhong fa xian I67Qtu bian zhu ke jiang chan wu li ti shua ze xing you ye sheng xing de 25%(S)di gao dao 72%(S),er S441Etu bian zhu shi xian le chan wu de you shi gou xing you Sni zhuai wei ji ,chan wu de eezhi wei 45%。kao lv dao liu mi lei de wu yu mo xing de wu de xiang shi xing ,wo men shua ze yi tu bian zhu 4M(167Q/P440F/A442N/L443I)wei mo ban ,jiang 67、440、442、443wei dian tu bian wei bu tong da xiao yi ji bu tong suan jian xing de an ji suan ,jin yi bu tan suo neng shi xian geng gao che gou xing li ti shua ze xing de tu bian zhu 。zui zhong fa xian gou cheng 4Mde 4chong chan tu bian de chan wu you shi gou xing dou shi Sgou xing ,er 4Mtu bian de you shi chan wu wei ji gou xing ,jin yi bu yan zheng le za yuan zi yang hua fan ying ji li de xiang shi xing ,dan yi 4Mwei mo ban de ji ta tu bian bing wei huo de gao li ti shua ze xing de shai shua jie guo 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自浙江大学的郑禾，发表于刊物浙江大学2019-07-17论文，是一篇关于定向进化论文,非天然反应论文,酮还原论文,杂原子氧化论文,浙江大学2019-07-17论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自浙江大学2019-07-17论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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