论文摘要
实验目的:探讨小鼠抗人CD44单克隆抗体（HI313）对髓系白血病细胞增殖、分化的影响。构建HI313单链抗体（ScFv）,为进一步治疗性抗体开发打下基础。实验方法:通过流式细胞仪检测,比较小鼠抗人CD44单克隆抗体HI313与HI44a的亲合力及竞争抑制作用;以胎盘兰计数和MTS法检测HI313对白血病细胞系增殖抑制的影响;Annexin V/PI和The Cycle TESETM PLUSDNA Reagent Kit检测HI313对NB4细胞凋亡及细胞周期影响;以及HI313对AML病人血细胞诱导分化作用;RT-PCR的方法克隆小鼠杂交瘤HI313的抗体轻、重链可变区基因,利用overlap-PCR方法构建HI313-ScFv融合基因,定向克隆入原核表达载体pET22b,构建重组质粒pET22b/HI313-ScFv。将重组质粒转染入BL21感受态菌株,在IPTG存在条件下,诱导表达HI313单链抗体。所得融合蛋白经复性、镍柱纯化后,通过流式细胞术检测其与天然细胞膜CD44蛋白的结合活性和特异性。实验结果:通过THP-1和KG1a细胞的检测,HI313克隆的相对亲合力分别为1.2nM和1.34nM;HI44a克隆的相对亲和力分别为3.5nM和5.89nM;免疫竞争实验表明HI313与HI44a识别不同抗原表位;HI313单克降抗体对NB4白血病细胞系具有强烈的抑制增殖作用,并使NB4细胞周期停留在G0/G1期;对AML病人血细胞诱导分化作用结果显示HI313可使髓系表面的成熟标志表达量增加。扩增HI1313重链可变区基因357bp,HI313轻链可变区基因339bp;成功构建HI313-ScFv单链抗体,能与KG1a细胞表面抗原结合。实验结论:HI313单克隆抗体具有高亲和力;且与HI44a克隆结合的不是一个抗原表位;HI313对NB4细胞具有增殖抑制作用,作用机制可能与阻滞细胞周期于G0/G1期相关;HI313能有效诱导AML病人血细胞的分化,并对AML病人的各亚型有一定的促分化作用,提示此抗体具有针对AML进行靶向治疗的潜力,为HI313人抗体的进一步基因工程改造及临床应用奠定了基础。