南极海洋微生物N2a鉴定、系统学及一种低温过氧化氢酶BNC纯化与性质研究

论文摘要

低温过氧化氢酶（EC1.11.1.6）是好氧低温生物代谢必需的抗氧化酶。低温过氧化氢酶研究对于认识海洋微生物在低温下有氧代谢活动规律有重要意义。本研究从南极海水中筛选出高活性过氧化氢酶菌株,鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus）细菌。详细研究了芽孢杆菌目（Bacillales）中产芽孢细菌尤其是芽孢杆菌属细菌的16S rDNA系统学,给出了新的分组结果。从海洋革兰氏阳性菌中分离纯化了过氧化氢酶并研究其性质,分析了低温酶和同源的中温酶差别不明显的现象。从南极表层海水中分离细菌并筛选高过氧化氢酶活性的菌株,获得的49株细菌用硫代硫酸钠滴定法初筛后,其过氧化氢酶活性都高于大肠杆菌的酶活。用紫外分光光度法复筛后有15株菌的过氧化氢酶活性高于藤黄微球菌的酶活。其中N2a菌株活性最高,超声破碎细胞后活性达1200 U/mg。49株细菌的形态与生理生化特征表明它们属于同种细菌。进一步测定N2a的脂肪酸含量与16S rDNA序列后将其鉴定为芽孢杆菌属的细菌。N2a是专性好氧,能运动,产芽孢的杆菌,主要脂肪酸为iso-C14:1,iso-C15:0,anteiso-C15:0和iso-C14:0。N2a与B. barbaricus、B. arsenicus,B. macauensis和B. gelatini的16S rDNA序列相似性分别为99.4%、97.9%、96.1%和95.3%。N2a的表型（4℃生长,7%NaCl生长）和脂肪酸含量（不饱和脂肪酸占40%以上）体现出低温海洋菌的特征,不同于和N2a的16S rDNA序列相近的菌株。所以N2a可能是Bacillus新种。好氧产芽孢的细菌的系统学长期以来研究较少,特别是Bacillus属及相近属的系统学存在问题。本文根据16S rDNA序列,用邻位连接法（NJ）、简约法（MP）、最小进化法（ME）、最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）五种算法构建了181种芽孢杆菌属及相关属细菌的系统进化树。BI算法得到的进化树最理想,其次是ML。各种系统进化树都表明,Bacillus不是单系群,芽孢杆菌属及相关属细菌可以划分为9个组。芽孢杆菌属模式种B. subtilis属于组1。N2a菌株属于组7。组4,组6和组8的细菌在表型上有一致性,分别为嗜热菌、嗜盐菌和嗜碱菌,而其它各组内的细菌在表型上无一致性。组2,组4和组8是由芽孢杆菌属及相关属细菌组成的,说明目前芽孢菌的分类系统和16S rDNA系统进化树不完全一致。组9主要由芽孢杆菌科除Bacillus以外的属组成,其中的4种芽孢杆菌可能属于其它的属。还有4种芽孢杆菌位于9个组之外,应建立新属或划入其它属。从Bacillus sp. N2a菌体中分离纯化其过氧化氢酶（BNC）,采用50 mmol/L pH7.5 Tris?Cl缓冲液。菌体超声波破碎并离心后加入硫酸铵粉末,收集40%至70%饱和度之间的沉淀,样品透析后使用?KTA FPLC进行离子交换和分子筛层析。DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析以NaCl梯度洗脱,在0.13 mol/L NaCl时收集活性峰。聚乙二醇20000浓缩样品后使用Sephacryl S200HR分子筛层析。得到的过氧化氢酶在变性和非变性条件下电泳均为单一条带,比活80000 U/mg。Sephacryl S200HR分子筛测定BNC分子量为230 kD,SDS-PAGE测得亚基分子量为56 kD,表明BNC是同源四聚体。Bio-Rad Rotofor等电聚焦电泳测得BNC的pI=4.2。BNC最适温度25℃,最适pH6-11,活性受叠氮钠、盐酸羟胺和巯基乙醇的抑制。这些性质表明BNC属于小亚基单功能过氧化氢酶。BNC的活化能13 kJ,表明它同其它小亚基单功能过氧化氢酶类似,属于非温度依赖性的酶。BNC在4℃和25℃的催化效率分别为3.6×106和4×106 M-1s-1。BNC低温下高催化效率保证代谢产生的过氧化氢被迅速清除。BNC的热稳定性低于来自中温芽孢杆菌的小亚基过氧化氢酶,可以认为BNC属于低温酶。BNC来自在自然环境中自由生活的细菌,可以作为低温小亚基单功能过氧化氢酶的代表。BNC和同源中温酶的活化能、催化效率及热稳定性差别不大,是低温酶的特例。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 过氧化氢酶研究进展
• 1.1.1 过氧化氢酶生物学功能
• 1.1.2 单功能过氧化氢酶（monofunctional catalase）分类、性质与空间结构
• 1.1.3 过氧化氢-过氧化物酶（catalase-peroxidase,CPX）和锰过氧化氢酶
• 1.1.4 过氧化氢酶的应用
• 1.2 低温生物与低温酶研究进展
• 1.2.1 低温生物适应低温的机理
• 1.2.2 低温酶（cold-adapted enzyme, psychrophilic enzyme）
• 1.2.3 研究意义与应用潜力
• 1.2.4 低温过氧化氢酶
• 1.3 海洋细菌分类系统学及多样性研究进展
• 1.4 本论文总体思路、解决的问题和意义
• 2 南极海水中高过氧化氢酶活性菌株的筛选与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 细菌分离
• 2.1.2 高过氧化氢酶活性菌株筛选
• 2.1.3 菌种鉴定
• 2.2 结果
• 2.2.1 菌株筛选
• 2.2.2 菌株形态与生理生化特征
• 2.2.3 细菌16S rDNA系统发育分析
• 2.2.4 细菌脂肪酸组成
• 2.3 讨论
• 2.3.1 细菌培养与过氧化氢酶
• 2.3.2 筛选方法与测活方法的选择
• 2.3.3 菌种鉴定
• 3 芽孢杆菌属及相关属细菌的系统进化关系
• 3.1 方法
• 3.2 结果与讨论
• 4 南极海洋芽孢杆菌低温过氧化氢酶分离纯化与性质
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 培养条件
• 4.1.2 纯化过程
• 4.1.3 酶活性与蛋白测定
• 4.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.1.5 物理化学性质
• 4.2 结果
• 4.2.1 酶的纯化
• 4.2.2 分子量、等电点与光谱学性质
• 4.2.3 最适pH、最适温度与热稳定性
• 4.2.4 酶的催化性质
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果