谷物中玉米赤霉烯酮酶联免疫检测方法的研究

论文摘要

本论文对生物毒素玉米赤霉烯酮的免疫分析方法进行了深入系统的研究,合成出玉米赤霉烯酮的半抗原,研究了半抗原与载体蛋白结合的方法,制备了高效价和高特异性的玉米赤霉烯酮抗体。通过对免疫分析形式与免疫分析的特异性、灵敏性的关系以及谷物基质中干扰物对酶联免疫分析方法的影响,建立了一种简便、快捷、实用的玉米赤霉烯酮免疫分析方法——直接竞争酶联免疫检测方法。此法灵敏度较高,IC50为0.06μg/kg,IC15为0.01μg/kg。在对实际样品进行检测的研究中,由于玉米赤霉烯酮广泛存在于各种谷物中,选取大麦、小麦、玉米、燕麦作为研究对象考查了它们的基质影响及其去除方法。四种样品经过甲醇提取后,大麦、小麦、燕麦样品的甲醇提取液用掩蔽剂稀释后可消除基质影响,玉米样品的甲醇提取液直接用PBS稀释后可消除基质影响。在方法的准确性实验中,在30,60,120μg/kg三个加标水平上,直接竞争酶联免疫检测方法的回收率在70～100%。通过高效液相色谱检测方法,对建立的玉米赤霉烯酮直接竞争酶联免疫检测方法的准确性进行了验证。两种方法检测结果具有较高的相关性,线性相关系数R2值为0.9828。根据本研究,进一步开发并制成检测玉米赤霉烯酮的试剂盒。所研制的玉米赤霉烯酮96孔板式快速检测试剂盒检测结果稳定、准确,抗干扰能力强,可用于大量样品的快速现场检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 真菌毒素引起的食品安全问题
• 1.2 真菌类生物毒素简介
• 1.2.1 玉米赤霉烯酮
• 1.2.2 黄曲霉毒素
• 1.2.3 储曲霉毒素
• 1.2.4 伏马毒素
• 1.2.5 单端孢霉烯族毒素
• 1.2.6 杂色曲霉菌素
• 1.2.7 展青霉素
• 1.2.8 串株镰刀菌素
• 1.2.9 桔霉素
• 1.3 玉米赤霉烯酮简介
• 1.3.1 理化性质及代谢
• 1.3.2 毒性
• 1.3.3 治疗及预防
• 1.3.4 玉米赤霉烯酮的限量
• 1.4 玉米赤霉烯酮检测方法简介及其研究进展
• 1.4.1 薄层色谱法
• 1.4.2 高效液相色谱法
• 1.4.3 气相色谱法
• 1.4.4 酶联免疫检测法
• 1.4.5 其他检测方法
• 1.5 酶联免疫分析方法简介
• 1.5.1 酶联免疫分析方法原理
• 1.5.2 酶联免疫分析方法的主要类型
• 1.5.3 酶联免疫方法的建立
• 1.5.4 多克隆抗体简介
• 1.5.5 单克隆抗体简介
• 1.5.6 重组抗体简介
• 1.5.7 酶联免疫分析方法在食品检测中的应用
• 1.5.8 酶联免疫分析方法研究现状
• 1.5.9 酶联免疫分析方法展望
• 1.6 本课题的研究意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品和试剂
• 2.1.2 仪器及材料
• 2.1.3 待测样品
• 2.1.4 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 玉米赤霉烯酮半抗原的合成
• 2.2.2 人工免疫原（ZEN-KLH）的制备
• 2.2.3 包被抗原（ZEN-OVA）的制备
• 2.2.4 抗体的制备
• 2.2.5 酶标抗原的制备
• 2.2.6 直接竞争酶联免疫检测方法的建立
• 2.2.7 玉米赤霉烯酮抗体特异性的测定
• 2.2.8 样品处理方法
• 2.2.9 玉米赤霉烯酮直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 2.2.10 仪器分析法确证
• 2.2.11 玉米赤霉烯酮直接竞争ELISA稳定性实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 合成玉米赤霉烯酮半抗原
• 3.1.1 玉米赤霉烯酮合成方法的选择
• 3.1.2 半抗原ZEN-CMO偶联物的表征
• 3.2 人工免疫原的制备
• 3.3 抗体的制备
• 3.3.1 抗血清效价的测定
• 3.3.2 抗体的纯化以及抗体浓度的确定
• 3.4 直接竞争酶联免疫检测方法的建立
• 3.4.1 酶标抗原浓度优化
• 3.4.2 直接竞争ELISA抗体包被浓度优化
• 3.4.3 直接竞争ELISA标样稀释液离子强度优化
• 3.4.4 直接竞争ELISA标样稀释液pH优化
• 3.4.5 玉米赤霉烯酮直接竞争ELISA标准曲线的绘制
• 3.5 玉米赤霉烯酮抗体特异性的测定
• 3.6 样品基质影响及消除
• 3.6.1 不同提取方法、不同稀释倍数对实验结果的影响
• 3.6.2 不同掩蔽剂对实验结果的影响
• 3.7 样品处理方法的确定及添加回收实验及检出限
• 3.7.1 不同提取方法对样品添加回收实验的影响
• 3.7.2 样品处理方法的确定
• 3.7.3 样品添加回收实验
• 3.8 四种样品的检出限
• 3.9 玉米赤霉烯酮直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 3.9.1 ELISA方法的检出限
• 3.9.2 ELISA方法的精密度
• 3.10 高效液相色谱法检测玉米赤霉烯酮
• 3.10.1 高效液相色谱检测玉米赤霉烯酮标准曲线的建立
• 3.10.2 样品处理
• 3.10.3 玉米赤霉烯酮直接竞争ELISA检测结果与仪器分析结果的一致性
• 3.11 玉米赤霉烯酮直接竞争ELISA稳定性实验
• 3.11.1 抗体稳定性实验
• 3.11.2 酶标抗原稳定性实验
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢