中国部分地区马流感病毒的分子流行病学调查和重组禽痘病毒载体疫苗的初步研究

论文摘要

马流感（equine influenza,EI）是由正黏病毒科A型流感病毒属引起的马属动物的一种常见的病毒性呼吸系统疾病。众所周知,A型流感病毒可以根据病毒粒子表面糖蛋白的差异划分成不同的亚型（H1-H16,N1-N9）,而感染马属动物的流感病毒通常是H7N7亚型或H3N8亚型。虽然H7N7亚型的马流感病毒在马群内已经消失很久,但是疫苗接种并没有有效地预防H3N8亚型马流感病毒在世界范围内的蔓延。我国是一个养马大国,历史上曾经发生过多次马流感疫情,给我过的养马业造成严重的经济损失;同时,我国的赛马业也正在逐步兴起。因此,本论文的主要研究内容是研究我国目前马流感病毒的遗传演化规律,选择适合在我国作为疫苗株应用的马流感病毒分离株,制备能够有效预防马流感疫情在我国蔓延的候选疫苗。2007年,我国新疆和田地区发生马流感疫情,发病动物除了马外,大量地方品种的驴也被感染,发病率较高,死亡率较低。我们采集发病驴的鼻拭子样品,进行病毒的分离鉴定。结果表明,有一份鼻拭子分离物能够在9-10日龄的鸡胚上进行增殖,收集尿囊液能够具有血凝效价,传代稳定后效价能够达到128价,病毒EID50为107.5/ml。通过对浓缩的鸡胚尿囊液以及病毒在细胞上传代之后的切片进行电镜检查,能够看到病毒粒子呈多形性,具有流感病毒的典型特征。小鼠致病性试验表明,该病毒株对小鼠致病性较低,病毒感染后不能引起小鼠出现临床症状和典型的病理变化。通过对该病毒株的全基因组各个节段的扩增和聚类分析表明,该流感病毒的8个节段都与马的流感病毒处于同一簇,为典型的马流感病毒。因此,本试验研究表明该病毒分离株为一株驴源的马流感病毒。为了有效地预防马流感疫情在我国的蔓延,我们除了加强对马的流感疫情监测,还应该加强对其他马属动物,如驴等,的马流感疫情的监测。最近几年来,我国一直发生马流感疫情。我国的周边国家如印度、蒙古、日本也发生马流感疫情。北美地区和欧洲及英国地区的马流感病例也时有发生。为了研究我国马流感病毒的遗传变异情况,我们从全国主要的养马地区,采集疑似马流感症状的鼻拭子样本,然后进行病毒分离和RT-PCR验证。通过对马流感病毒全基因组各个节段的序列比对和遗传进化分析表明,我国近年来分离的马流感病毒为佛罗里达II型的H3N8马流感病毒,与蒙古分离株A/Mongolia/1/2008和印度分离株A/equine/Jammu-Katra/6/2008同源性较近,这些病毒都起源于欧洲近年来流行的佛罗里达II型马流感病毒,但与日本分离株在遗传进化树上处于不同的进化分支,同时与我国上世纪90年代分离的马流感病毒（欧洲型）也处于明显不同的进化分支。与其它分支的马流感病毒相比,我国流行的马流感病毒HA蛋白一些抗原位点上的关键氨基酸发生改变,有意思的是A/equine/Liaoning/9/2008由于165位氨基酸位点的改变使得该病毒在位置发生一处糖基化位点的缺失。以上结果表明,我国的马流感疫情发生了新的遗传演化情况,这需要我们进一步加强我国的马流感疫情监测。近几年来,我国一直受到马流感疫情的威胁。许多养马地区并未接种马流感疫苗,并且我国也没有自己的马流感疫苗可用,马流感疫苗还主要依赖进口。鉴于此,本研究拟用禽痘病毒载体表达系统来进行马流感疫苗的研制,以希望能够制备出适合在我国应用的马流感疫苗。首先我们构建了分别表达欧洲系马流感病毒A/equine/Qinghai/1/1994和美洲系马流感病毒A/equine/Xinjiang/3/2007的保护性抗原基因HA基因的重组禽痘病毒载体,通过western-blot和IFA鉴定,我们所构建的重组病毒能够和马流感病毒特异性的阳性血清发生反应,说明我们构建的重组病毒能够正确地表达外源基因。这为进一步研究该重组疫苗对实验动物的保护效果奠定了基础。为了进一步验证该重组禽痘病毒载体疫苗的保护效果。本试验进一步研究了重组禽痘病毒疫苗的动物实验情况。首先,我们将重组病毒分组免疫小鼠,疫苗免疫后进行攻毒保护试验,试验结果表明,本研究所构建的两个重组病毒均能够诱导小鼠产生针对病毒的抗体;攻毒后,重组病毒免疫组能够保护小鼠抵抗流感病毒的攻击,而对照组小鼠均感染马流感病毒。进一步马体试验表明,本研究所构建的重组病毒能够诱导马产生针对马流感病毒的抗体,疫苗免疫组在攻毒后偶尔能够分离到病毒,而对照组在攻毒后持续能够分离到病毒。通过本研究证实,我们所构建的表达H3N8亚型马流感病毒的重组禽痘病毒载体疫苗能够保护小鼠和马抵抗流感病毒的感染,该重组疫苗具有良好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 病原体
• 1.2 EI 流行病学史
• 1.3 国际马匹运输情况
• 1.4 近年来EI 流行病学
• 1.5 跨种传播
• 1.6 马流感疫苗株选择
• 1.7 保护性免疫应答
• 1.7.1 体液免疫
• 1.7.2 细胞免疫
• 1.8 马流感病毒疫苗
• 1.8.1“死”疫苗
• 1.8.2 灭活流感全病毒疫苗
• 1.8.3 亚单位疫苗
• 1.8.4 DNA 疫苗
• 1.8.5 病毒或载体疫苗
• 1.8.6 活减毒流感病毒疫苗
• 1.8.7 病毒载体疫苗
• 1.8.8 用反向遗传学设计的活弱毒流感病毒
• 1.9 母源抗体和年龄对马流感疫苗的影响
• 1.10 本研究的目的与意义
• 第二章 一株驴源马流感病毒的分离鉴定及其生物学特性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 鸡血红细胞制备
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 抗体
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 病毒分离
• 2.1.7 病毒鉴定
• 2.1.8 电镜观察
• 2.1.9 病毒滴度测定
• 2.1.10 小鼠致病试验
• 2.1.11 EIV 基因组克隆
• 2.1.12 EIV 基因组序列分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 病毒分离
• 2.2.2 病毒滴度测定
• 2.2.3 形态学观察
• 2.2.4 小鼠致病试验
• 2.2.5 EIV 全基因组各节段的克隆、鉴定及序列测定
• 2.3 讨论
• 第三章 我国部分地区马流感病毒分子流行病学调查研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 毒株
• 3.1.3 毒株的地理分布情况
• 3.1.4 序列分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 HA 基因遗传演化分析
• 3.2.2 HA 基因氨基酸序列分析
• 3.2.3 NA 基因的遗传演化分析
• 3.2.4 内部结构基因的遗传演化分析
• 3.3 讨论
• 第四章 表达 H3N8 亚型马流感病毒 HA 基因的禽痘病毒载体的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 毒株和抗体
• 4.1.2 载体
• 4.1.3 工具酶与试剂
• 4.1.4 鸡胚成纤维细胞的制备
• 4.1.5 FPV-017 种毒的扩大培养以及病毒含量的滴定
• 4.1.6 表达H3N8 亚型马流感病毒HA 基因的重组禽痘病毒载体的构建
• 4.1.7 重组载体的鉴定
• 4.1.8 转染用质粒的准备
• 4.1.9 转染
• 4.1.10 重组禽痘病毒的筛选和纯化
• 4.1.11 重组禽痘病毒的鉴定
• 4.1.12 重组禽痘病毒载体表达EIV HA 蛋白的间接免疫荧光检测
• 4.1.13 重组病毒的western blot 检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 pSY538-HA 重组质粒的构建
• 4.2.2 pSY681-LP2EP2-HA 重组质粒的构建
• 4.2.3 pSY681-LP2EP2-HA-Lac Z 重组质粒的构建
• 4.2.4 重组禽痘病毒的获得
• 4.2.5 重组病毒的PCR 鉴定
• 4.2.6 Western blot 鉴定
• 4.2.7 IFA 检测
• 4.3 讨论
• 第五章 重组禽痘病毒载体疫苗免疫保护效果的初步研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验动物
• 5.1.2 疫苗成分
• 5.1.3 攻毒用毒株
• 5.1.4 血凝/血凝抑制试验
• 5.1.5 重组病毒的在小鼠模型上的免疫保护试验
• 5.1.6 重组病毒的马体保护试验研究
• 5.2 结果
• 5.2.1 重组病毒增殖
• 5.2.2 小鼠免疫攻毒试验效果
• 5.2.3 马体免疫攻毒试验
• 5.3 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介