聚氨酯泡沫半固定化培养盘基网柄菌的研究

论文摘要

盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum，D．discoideum）属真菌界的粘菌亚界的聚粘霉属（Acrasiomzcetes）。作为异源蛋白表达系统，盘基网柄菌N-，O-糖基化机制与高等真核生物很相似，且培养过程不需添加血清等特殊成分，成本低廉。但盘基网柄菌在复杂培养基中的悬浮培养密度只能达到1-2×107ml-1，且生长速度较慢，这严重影响了盘基网柄菌表达系统的应用。本文采用聚氨酯泡沫半固定化的方法培养盘基网柄菌。通过分析盘基网柄菌在聚氨酯泡沫载体中的固定化情况，菌体在载体中的分布情况以及电镜扫描结果，确定聚氨酯泡沫载体与菌体有良好的生物相容性并能有效的吸附固定盘基网柄菌细胞。通过实验进一步研究了转速，载体添加量及载体尺寸等因素对盘基网柄菌在聚氨酯泡沫载体中固定化的影响。通过考察载体密度、载体尺寸、载体量和摇床转速等因素对菌体固定化培养的影响，优化了聚氨酯泡沫半固定化培养盘基网柄菌的条件，添加饼状聚氨酯泡沫1.0g，22-23℃，150rpm条件下固定化培养盘基网柄菌，在115小时左右，载体内菌体密度达到4.56×107ml-1，为悬浮培养的2-4倍。通过分析比较悬浮培养及固定化培养条件下的菌体的生长曲线，发现采用聚氨酯泡沫固定化培养法，菌体生长速度没有受到明显影响。最后，对本实验室构建的引入6-his标签的人FasL重组盘基网柄菌表达产物进行了分离纯化。结果显示，该重组菌可以有效的表达人FasL。经过一步金属亲和层析，得到纯度为92.1％的重组蛋白，分离回收率为91.0％。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 异源蛋白表达系统
• 1.2 盘基网柄菌表达系统
• 1.2.1 盘基网柄菌简介
• 1.2.2 盘基网柄菌表达系统的优越性
• 1.2.3 盘基网柄菌表达异源蛋白研究进展
• 1.2.4 盘基网柄菌的培养
• 1.3 聚氨酯泡沫固定化载体
• 1.4 人Fas配体
• 1.5 本文研究思路与内容
• 1.5.1 选题意义
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌株及质粒
• 2.2 实验试剂
• 2.4 培养基及缓冲液
• 2.5 聚氨酯泡沫载体
• 2.6 菌种保藏
• 2.7 实验方法
• 2.7.1 孢子活化
• 2.7.2 种子培养
• 2.7.3 盘基网柄菌的摇瓶悬浮培养
• 2.7.4 聚氨酯泡沫固定化培养盘基网柄菌
• 2.7.5 盘基网柄菌在聚氨酯泡沫中固定化效果的测定
• 2.8 分析方法
• 2.8.1 细胞浓度的测定
• 2.8.2 固定化比率的测定
• 2.8.3 电镜分析聚氨酯泡沫固定化培养的盘基网柄菌
• 第三章 聚氨酯泡沫固定化性能的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 盘基网柄菌菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 聚氨酯泡沫载体
• 3.2.4 摇瓶悬浮培养盘基网柄菌
• 3.2.5 摇瓶固定化培养盘基网柄菌
• 3.2.6 菌体在聚氨酯泡沫载体中固定化效果的测定
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 固定化载体内细胞浓度测定方法的确立
• 3.3.2 聚氨酯泡沫载体生物相容性的初步研究
• 3.3.3 各种固定化影响因子的考察
• 第四章 PUF固定化培养盘基网柄菌
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 盘基网柄菌菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 聚氨酯泡沫载体
• 4.2.4 摇瓶培养盘基网柄菌
• 4.3 盘基网柄菌的培养
• 4.3.1 固定化培养与悬浮培养的初比较
• 4.3.2 固定化培养的条件优化
• 4.3.3 小结
• 第五章 人Fas配体的表达与初步分离纯化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株及质粒
• 5.2.2 培养基及培养条件
• 5.2.3 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 6-his FasL的纯化
• 5.3.2 重组蛋白的表达曲线
• 5.3.3 培养基组成对6-his hFasL重组蛋白表达的影响
• 5.3.4 培养基pH对6-his hFasL重组蛋白表达的影响
• 5.3.5 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 论文中缩略词
• 致谢
• 论文发表情况