晚期糖基化终产物诱导内皮细胞内ERM蛋白和黏附连接蛋白改变及其作用机制的实验研究

论文摘要

研究目的:本课题以原代培养的人脐静脉内皮细胞（Human umbilical veinendothelial cells,HUVECs）为对象,应用细胞培养、细胞免疫化学等方法观察不同浓度和不同作用时间的晚期糖基化终产物（Advanced Glycation Endproducts,AGEs）修饰的人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）对内皮细胞ERM（Ezrin/Radixin/Moesin）蛋白定位及其磷酸化水平的影响,并初步探讨其机制。同时研究内皮细胞黏附连接钙黏着蛋白（VE-cadherin）和细胞骨架纤维状肌动蛋白（filamentous actin,,F-actin）在AGEs作用下的形态结构改变及其产生的机制。通过上述研究试图阐明AGEs对血管内皮细胞的影响以及可能的信号转导通路,为进一步阐明与AGEs相关的动脉硬化及糖尿病血管并发症等多种心血管疾病的发生机制提供实验依据,并为其防治提供新的思路和有效手段。研究方法:AGEs修饰的人血清白蛋白（AGE-modified human serum albuminAGE-HSA）,由人血清白蛋白与D-葡萄糖共孵育8周制得。由人脐带静脉消化分离而获得的原代培养的人脐静脉内皮细胞分别接种于微孔小皿（petri dish）和六孔板中待细胞长至融合后,换无血清培养基使细胞获得同步生长。用不同浓度的AGEs与HUVECs在体外共同培养不同时间,并设立HSA阴性对照组进行比较。在各实验组中,分别利用可溶性RAGE的抗体（anti-RAGE IgG）、细胞外信号调节激酶通路（extracellular signal regulated kinase,ERK）上游激酶抑制剂PD98059、p38丝裂原激活的MAPK通路上游激酶抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125及Rho激酶抑制剂Y27632,预处理内皮细胞;另外,利用重组腺病毒MEK1,MKK6b,p38α,p38β,的无活性型突变体预转染内皮细胞24h,继以AGEs再孵育;或重组腺病毒MEK1,MKK6b的活性突变体单独转染细胞。采用间接免疫荧光染色法,利用激光共聚焦显微镜观察细胞内ERM蛋白和钙黏着蛋白的细胞内定位和形态改变,直接探针罗丹明—鬼笔环肽（Rhodamine—phalloidin）显示F-actin形态改变。另外采用免疫蛋白印迹法检测各实验组细胞内VE-cadherin表达水平。研究结果:1.随着AGEs剂量加大和作用时间的延长正常时存在于细胞周边的磷酸化的ERM蛋白逐渐向细胞内移位,在胞浆中明显增多而非磷酸化总ERM细胞内定位则无明显改变。AGEs受体的可溶性抗体anti-RAGE可逆转AGEs引起的和ERM蛋白定位和磷酸化状态的改变。Rho激酶抑制剂Y27632明显抑制AGEs诱导的ERM蛋白定位和磷酸化状态改变。ERK抑制剂PD98059及其上游激酶无活性的重组腺病毒突变体MEK1转染后可以减弱AGEs导致的内皮细胞内ERM蛋白磷酸化改变。p38MAPK通路抑制剂SB203580及p38 MAPK上游激酶MKK6b及P38α、β的无活性重组腺病毒突变体转染后可显著减轻AGEs诱导的ERM蛋白定位及磷酸化状态的改变。2.随着AGEs剂量加大和作用时间的延长,VE-cadherin的形态逐渐发生改变。正常未受刺激的内皮细胞内VE-cadherin位于细胞周边,边缘光滑,AGEs作用后呈锯齿性改变,有些部位缺失断裂。蛋白印迹Western blotting结果显示,AGEs剂量加大和作用时间的延长对细胞内VE-cadherin表达没有明显影响。AGEs受体的可溶性抗体anti-RAGE可逆转AGEs引起的VE-cadherin形态结构的改变。Rho激酶抑制剂Y27632明显抑制AGEs诱导的VE-cadherin形态结构改变。ERK抑制剂PD98059及其上游激酶无活性的重组腺病毒突变体MEK1转染后可以减弱AGEs导致的内皮细胞VE-cadherin改变。p38MAPK通路抑制剂SB203580及p38 MAPK上游激酶MEK6b及p38α、β的无活性重组腺病毒突变体转染后可显著减轻AGEs诱导的VE-cadherin改变。JNK激酶抑制剂SP600125可以显著减轻AGEs诱导的VE-cadherin改变。结论:1.AGEs以时间和剂量依赖的方式引起磷酸化ERM蛋白改变。AGEs与RAGE结合引起ERM蛋白磷酸化。p38和ERK通路及Rho激酶参与了AGEs诱导的ERM蛋白改变的过程。2.AGEs通过与RAGE结合后以时间和剂量依赖的方式引起VE-cadherin形态结构改变。ERK、p38和JNK/SAPK信号通路及Rho激酶参与了AGEs诱导的VE-cadherin形态改变的过程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 AGEs对内皮细胞ERM蛋白磷酸化和分布的影响及其机制
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 第二部分 AGEs对内皮细胞黏附连接蛋白VE-cadherin形态结构和表达的影响及其机制
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢