论文摘要
生殖细胞的发生是发育生物学研究的重要领域。vasa基因在许多动物生殖系细胞中具有表达特异性,被广泛用作生殖细胞的分子标记物,在动物生殖细胞发生和生殖调控等研究中起到了重要的作用。仿刺参（Apostichopus japonicus）俗称刺参,是我国主要的棘皮动物经济种类,然而迄今尚未见对其生殖系起源和性腺发生的研究报道。本文采用同源克隆策略和cDNA末端快速扩增（RACE）技术,克隆了刺参Aj-vasa全长cDNA序列,对其进行了序列特征和时空表达分析,并以Aj-vasa mRNA为标记,研究了刺参原生殖细胞的起源;进一步采用组织学技术,观察了刺参性腺的早期发生。克隆得到的Aj-vasa基因cDNA序列全长2167 bp,含有开放阅读框1593 bp,编码530个氨基酸。5′非翻译区（UTR）为449 bp,3′UTR为125 bp。推导的氨基酸序列具有DEAD-box家族蛋白的全部9个保守结构域以及GG重复序列。同时在该基因的蛋白序列中还发现了ARKF框,该框只在DEAD-box家族VASA和PL10蛋白中保守存在,而在其他亚家族中并未发现。同源性比对和进化分析显示该基因编码蛋白与其他物种的VASA相关蛋白具有较高的相似性,证明VASA蛋白在进化上高度保守。蛋白三维结构预测蛋白功能显示该蛋白Aj-VASA具备了DEAD-box家族蛋白RNA连接,ATP酶和解旋酶的功能。半定量RT-PCR分析显示,Aj-vasa基因在成体性腺组织中特异表达;原位杂交结果表明Aj-vasa mRNA主要在精原、精母细胞和卵母细胞的胞质中表达显著,推测该基因可能参与刺参两性配子的发生。胚胎和幼虫半定量RT-PCR分析检测到从未受精卵到耳状幼虫都含有Aj-vasa mRNA。表达量自未受精卵至囊胚期逐渐升高,原肠胚至耳状幼虫表达量逐渐降低。整体原位杂交结果显示:从未受精卵到囊胚期,Aj-vasa mRNA在各细胞胞质中均有分布,原肠胚阶段Aj-vasa阳性细胞集中在内、中胚层处,小耳状幼虫阶段阳性细胞分布在消化道及水体腔囊处,随后出现在水体腔及左右体腔处,并在樽形幼虫及五触手幼虫期分布在身体左右两侧的球状体处,到稚参期,强阳性信号前移至身体前端,到1mm幼参期,表达Aj-vasa的细胞已集中于背系膜处,这些细胞即为原始生殖细胞。对1mm至3cm的幼参进行石蜡切片,结果显示:1～3mm幼参中,原始生殖细胞数个集群被包在背系膜处,形成性腺原基;5mm幼参性腺原基中开始出现空腔,具有了性腺雏形;至3cm幼参,性腺开始出现分支,其形态接近成体性腺形态。