猪卵母细胞胞质内单精子注射初步研究

论文摘要

本研究探讨了不同辅助激活方法和精子的不同预处理方法对猪卵胞质内单精子注射（ICSI）胚胎体外发育的影响,并对ICSI介导生产猪转基因胚胎的方法进行了初步尝试。探讨了不同辅助激活方法对猪卵子ICSI后胚胎发育的影响。液氮一次冻融精子胞质内注射后分组以1DC（直流电1.30kv/cm、80μs一次电脉冲）、1DC+6-DMAP（1DC电激活后间隔4h联合6-DMAP处理5h）、Ionomycin+6-DMAP（Ionomycin 5min预激活后4h联合6-DMAP处理5h）三种方法进行辅助激活,以2PN+2PB原核类型为正常受精的标准。结果发现1DC+6-DMAP、Ionomycin+6-DMAP两激活组正常受精率显著高于1DC单独激活组（32.76%、30.16%vs 16.67%,P＜0.05）;胚胎分裂率和囊胚率也都显著高于1DC激活组（60.74%、57.81%vs 33.62%,P＜0.05;16.82%、13.28%vs 5.17%,P＜0.05）但两联合辅助激活组之间均差异不显著（P＞0.05）;三种激活方法之间第二极体排出率差异不显著（66.67%、68.97%和63.49%,P＞0.05）。探讨了精子不同预处理方法对猪卵子ICSI后胚胎原核形成及胚胎发育的影响。以新鲜精子为对照组,结果显示0.1%TritonX-100孵育精子以及冻融精子行ICSI胚胎分裂率和囊胚率均显著高于对照组（66.13%、65.18%vs38.71%,P＜0.05;15.32%、16.07%vs 9.68%,P＜0.05）,但实验组之间差异不显著（P＞0.05）;经0.1%TritonX-100和冻融处理的精子行ICSI,胚胎正常受精率、雄原核形成率以及雄原核形成或精子头部解聚率均显著高于新鲜精子（38.46%、36.21%vs 20.83%;50.0%、48.26%vs 22.92%;71.15%、72.41%vs 47.92%,P＜0.05）。探讨了ICSI介导生产转基因猪胚胎的可行性。以线性化pEGFP-N1质粒与冻融精子共孵育后进行ICSI操作,结果显示其与常规冻融精子做供体相比,猪卵子ICSI后胚胎的分裂率差异不显著（60.37%vs 65.18%,P＞0.05）,但囊胚率显著降低（8.49%vs 16.07%,P＜0.05）。以2～4细胞时期胚胎统计,转基因阳性胚胎率为32.61%。以上结果表明:（1）1DC+6-DMAP（1DC电激活后间隔4h联合6-DMAP处理5h）和Ionomycin+6-DMAP（Ionomycin 5min预激活后4h联合6-DMAP处理5h）均适合于猪卵子ICSI后胚胎的激活;（2）液氮一次冻融精子和0.1%TritonX-100孵育精子均能显著提高猪卵子ICSI后胚胎雄原核形成率和胚胎发育潜力;（3）ICSI介导精子载体法用于生产猪转基因胚胎是可行的,但精子与外源基因共孵育条件还需要进一步优化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 （综述部分）
• 哺乳动物胞质内单精子注射研究进展
• 1 前言
• 2 单精子显微受精技术的研究简史
• 3 猪胞质内单精子注射的研究进展
• 4 胞质内单精子受精的基本操作程序
• 5 影响ICSI效率的关键因素
• 6 ICSI介导转基因的研究进展
• 7 ICSI介导转基因中精子载体的处理
• 8 ICSI取得的成就和存在的问题
• 9 ICSI的应用前景
• 第二部分 （试验部分）
• 第一章 精子预处理和卵母细胞激活对猪卵子ICSI后胚胎发育的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二章 胞质内单精子注射（ICSI）介导生产猪转基因胚胎的尝试
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况