拟南芥J-蛋白基因功能的研究

论文摘要

J-蛋白是一类包含J结构域的蛋白质,拟南芥中存在90多种J-蛋白基因,构成了一个多基因超家族。AtJ72、AtJ70和AtJ24是拟南芥J-蛋白家族的成员。关于这三个基因的功能还未见任何报道。本文对AtJ72、AtJ70和AtJ24这三个基因的突变体进行了生长发育过程中的表型观察和环境胁迫下的耐性分析,旨在研究这三个基因在生长发育及对环境胁迫的适应过程中的可能功能。通过PCR方法分别鉴定并获得了AtJ72、AtJ70和AtJ24基因的T-DNA插入纯合突变体,并用RT-PCR的方法对纯合突变体进行了转录水平的鉴定,各种突变体均没有产生相应基因的转录本,说明这三种基因由于T-DNA的插入而被敲除。在正常生长条件下对野生型和突变体植株进行了表型的观察及比较。结果表明,AtJ72、AtJ70和AtJ24突变体的生长发育进程与野生型植株无明显差别,主要表现在胚根、胚芽、子叶出现时间,抽苔、开花时间,以及根长、莲座半径和茎高方面。分别对野生型及几种突变体进行热,冷,冻,盐胁迫等处理。结果发现AtJ72突变体对盐胁迫的抵抗能力明显比野生型弱,而对热、冷冻和水分胁迫的耐性与野生型无明显差异,说明AtJ72基因可能与耐盐性相关。AtJ70和AtJ24突变体在热、冷冻、盐胁迫处理后,幼苗生活力与野生型均无明显差异。构建了含有融合基因的双元载体pCAMBIA1300AtJ72-GFP,将双元载体转入农杆菌GV3101,利用浸花法转化拟南芥,在抗性培养基上筛选获得阳性转基因苗。PCR扩增出融合基因AtJ72-GFP,表明抗性苗确为转基因株系。利用激光共聚焦扫描显微镜观察转基因小苗的根部细胞,以转空载体GFP作为对照,结果表明AtJ72基因可能定位在细胞壁或细胞膜上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 热激蛋白
• 2 分子伴侣
• 3 J-蛋白
• 3.1 J-蛋白的结构及多样性
• 3.2 J-蛋白的生理功能
• 3.2.1 J-蛋白作为辅分子伴侣与HSP70 组成分子伴侣机器
• 3.2.2 J-蛋白参与信号转导过程
• 3.2.3 J-蛋白对环境刺激的反应及其它作用
• 4 拟南芥中J-蛋白研究
• 4.1 拟南芥简介
• 4.2 拟南芥中J-蛋白的研究
• 5 报告基因知识
• 5.1 绿色荧光蛋白特性
• 5.2 GFP 作为报告基因在分子生物学研究中的应用
• 材料和方法
• 1 实验材料
• 2 试剂及实验设备
• 3 实验方法
• 3.1 拟南芥的种植
• 3.2 植物基因组DNA 小量提取
• 3.3 PCR 扩增目的片断
• 3.4 RNA 的提取
• 3.5 RT-PCR 检测基因转录本的有无
• 3.6 目的片段的亚克隆及鉴定
• 3.7 DNA 琼脂糖电泳
• 3.8 质粒DNA 的小量提取（碱裂解法）
• 3.9 DNA 酶切
• 3.10 DNA 片段的回收
• 3.11 DNA 片段的连接
• 2 法细菌感受态细胞的制备'>3.12 CACL₂法细菌感受态细胞的制备
• 3.13 细菌转化
• 3.14 农杆菌感受态细胞的制备
• 3.15 农杆菌的转化及鉴定
• 3.16 拟南芥的转化及筛选
• 3.17 突变体表型观察
• 3.18 突变体在环境胁迫下的耐性分析
• 3.18.1 热激处理
• 3.18.2 冷胁迫
• 3.18.3 冻胁迫
• 3.18.4 盐胁迫
• 3.18.5 旱胁迫
• 结果与分析
• 第一部分 拟南芥ATJ72 功能及亚细胞定位的研究
• 1 ATJ72 基因的功能
• 1.1 ATJ72 基因T-DNA 插入纯合突变体的筛选与鉴定
• 1.1.1 AtJ72 基因T-DNA 插入位点
• 1.1.2 纯合突变体的筛选
• 1.1.3 突变体中T-DNA 插入拷贝数的鉴定
• 1.1.4 突变体中AtJ72 基因转录本的鉴定（RT-PCR）
• 1.2 ATJ72 在植物生长发育过程中的功能
• 1.2.1 AtJ72 突变对根生长的影响
• 1.2.2 AtJ72 突变对莲座发育的影响
• 1.2.3 AtJ72 突变对抽苔时间的影响
• 1.2.4 AtJ72 突变对茎高的影响
• 1.2.5 AtJ72 突变对下胚轴伸长的影响
• 1.2.6 AtJ72 突变体与野生型生长进程的比较
• 1.3 ATJ72 在植物对环境适应中的作用
• 1.3.1 热激胁迫
• 1.3.2 冷、冻胁迫
• 1.3.3 盐胁迫
• 1.3.4 水分胁迫
• 2 ATJ72 蛋白的亚细胞定位
• 2.1 ATJ72 基因的克隆
• 2.1.1 RT-PCR 扩增AtJ72 基因
• 2.1.2 PCR 产物的测序
• 2.2 PCAMBIA1300-35S : ATJ72-GFP 双元表达载体的构建
• 2.3 ATJ72-GFP 融合基因的遗传转化
• 2.3.1 双元载体转化农杆菌GV3101
• 2.3.2 农杆菌转化拟南芥及阳性苗的筛选
• 2.4 ATJ72 蛋白亚细胞定位的检测
• 第二部分 拟南芥AtJ70 功能的研究
• 1 ATJ70 基因T-DNA 插入突变体的鉴定
• 1.1 ATJ70 基因T-DNA 插入位点
• 1.2 ATJ70 基因T-DNA 插入纯合突变体的筛选
• 1.3 突变体T-DNA 插入拷贝数的鉴定
• 1.4 突变体ATJ70 转录本的鉴定（RT-PCR）
• 2 ATJ70 突变体表型的观察
• 2.1 ATJ70 突变对根生长的影响
• 2.2 ATJ70 突变对莲座生长的影响
• 2.3 ATJ70 突变对茎高的影响
• 2.4 ATJ70 突变体与野生型生长进程的比较
• 3 ATJ70 突变体在环境胁迫下的耐性分析
• 3.1 热激胁迫
• 3.2 冷，冻胁迫
• 3.3 盐胁迫
• 第三部分 拟南芥ATJ24 功能的研究
• 1 ATJ24 基因T-DNA 插入突变体的鉴定
• 1.1 ATJ24 基因T-DNA 插入位点
• 1.2 ATJ24 基因T-DNA 插入纯合突变体的筛选
• 1.3 突变体T-DNA 插入拷贝数的鉴定
• 1.4 突变体ATJ24 转录本的鉴定（RT-PCR）
• 2 ATJ24 突变体表型的观察
• 2.1 ATJ24 突变对根生长的影响
• 2.2 ATJ24 突变对莲座发育的影响
• 2.3 ATJ24 突变对茎高的影响
• 3 ATJ24 基因突变体在环境胁迫下的耐性分析
• 3.1 热激胁迫
• 3.2 冷、冻胁迫
• 3.3 盐胁迫
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩写表
• 致谢