论文摘要
目的意义:NDRG2基因是1999年从正常人全脑cDNA文库中克隆到的新基因[GenBank登录号AF159092.],染色体定位于14q12.1,基因组中由15个内含子,16个外显子构成。NDRG2基因的cDNA全长为2024 bp,编码357个氨基酸的蛋白质,分子量约41kD。目前研究表明,NDRG2基因在多种肿瘤组织或细胞系如结肠癌、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和腮腺癌中无表达或低表达,相反在上述肿瘤相应的正常组织细胞中有较高水平的表达。另外在中枢神经系统的大脑皮质、白质、神经核,唾液腺上皮细胞和骨骼肌细胞中高表达。同时基因转染实验表明,NDRG2可抑制胶质瘤BT325细胞由G1期向S期的过渡,因此,推测NDRG2可能是一种新的抑癌基因。本研究的目的意义是探讨NDRG2基因在肾癌发病机制中的作用,确定NDRG2基因的功能,为肾癌的防治提供理论依据。实验方法:采用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法确定NDRG2在肾癌细胞系、肾脏细胞系及正常组织和肾癌组织的表达;构建NDRG2的腺病毒表达载体并进行腺病毒的包装及滴度测定,获得高滴度的重组NDRG2腺病毒用于后续的细胞功能实验研究;用NDRG2重组腺病毒转染经证实低表达NDRG2的肾透明细胞癌细胞系A-498中,提高该细胞中NDRG2表达水平,通过流式细胞术分析细胞周期并检测凋亡,并运用蛋白免疫印迹检测细胞周期相关蛋白的变化;通过p53重组腺病毒转染肾癌A-498细胞,观察p53基因对NDRG2基因表达的影响。实验结果:1、通过免疫组织化学、RT-PCR、蛋白印迹等检测了人肾癌组织和人肾小管上皮细胞系、肾癌细胞系中NDRG2蛋白和mRNA的表达,结果显示:人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系、人胚肾上皮细胞HKC细胞系中NDRG2的mRNA表达水平较高;而在肾癌细胞系786-O、A-498中NDRG2的mRNA表达水平较低;NDRG2 mRNA在18例肾癌患者肿瘤组织中的表达水平较其相应癌旁组织低,且该表达与其病理分级呈正相关趋势;仅有6例患者的肾肿瘤组织中NDRG2的mRNA表达水平高于相对应的自身肿瘤瘤旁组织;另外有14例患者两者NDRG2 mRNA的表达无差异。2、采用美国Novagen公司成熟的pAdTrack-CMV腺病毒表达系统首先构建了含有NDRG2基因的重组穿梭载体,通过脂质体转染法将线性化的重组穿梭载体与骨架蛋白载体转染293细胞获得了原始病毒种,通过挑选单蚀斑进一步感染293细胞获得了单蚀斑病毒裂解液,在此基础上我们建立了原始种子批、主种子批及工作种子批,最后用工作种子批完成了pAd-GFP-NDRG2重组腺病毒的生产、病毒的纯化及病毒滴度的测定,最终获得的重组腺病毒滴度为1.1×1011pfu /ml。3、通过蛋白印迹实验证实重组腺病毒pAd-GFP-NDRG2转染可增加A-498细胞内源性NDRG2的表达水平;随后的MTT检测结果表明:A-498细胞病毒转染组,各检测时间点MTT OD值均低于未转染和空质粒转染组,48h差异具有显著性,说明NDRG2表达对A-498细胞生长具有抑制作用;进一步的细胞周期分析显示:A-498细胞质粒转染组出现G1期阻滞（G1期捕获）,提示NDRG2通过细胞周期阻滞来抑制A-498细胞增殖;凋亡检测实验结果显示:与未转染的A-498细胞（1.0%）和不含插段的重组腺病毒感染的A-498细胞（2.0%）相比,含NDRG2插段的重组腺病毒组感染的A-498细胞中凋亡细胞明显增多,感染48h后达12.0%;最后通过蛋白印迹实验检测发现:人NDRG2基因转染A-498细胞后,周期素蛋白cyclinD1、cyclinE表达减少,cyclinD2、cyclinD3和cdk2表达无明显变化,由此推测NDRG2基因抑制细胞增殖可能是通过影响周期素蛋白D1和E起作用的。4、通过蛋白印迹和RT-PCR发现A-498细胞表达没有活性的p53,但是基本检测不到NDRG2的表达;通过转染活化型p53基因到A-498细胞后观察到了NDRG2表达水平的升高,且呈剂量依赖关系,该结果说明NDRG2可受到p53基因的调控,提示NDRG2也是p53的一个下游基因。实验结论:NDRG2在正常肾组织中高表达,而在肾癌组织中出现低表达或无表达;NDRG2能够抑制肾癌A-498细胞的增殖,并能产生G1期阻滞,抑制细胞周期素D1、E的表达;p53的表达能够上调NDRG2的表达,本研究的结果进一步证实NDRG2基因是一种新的抑癌基因,以其为靶点的基因治疗策略可为肾癌的基因治疗提供新思路。