利用酵母双杂交系统筛选与猪Calsarcin-1基因相互作用的蛋白

论文摘要

Calsarcin（Calcineurin-associated sarcomeric protein）基因家族是一个与钙调神经磷酸酶（Calcineurin）结合的肌肉特异蛋白质新家族,已发现的Calsarcin基因家族成员有Calsarcin-1、Calsarcin-2和Calsarcin-3。其中,Calsarcin-1基因在心肌和骨骼肌慢肌纤维中特异表达,Calsarcin-2和Calsarcin-3只在骨骼肌的快肌纤维中特异表达。研究证实,Calsarcin-1基因敲除小鼠的肌肉过度生长,Calcineurin活性升高,表明Calsarcin-1抑制Calcineurin的活性。因此,Calsarcin-1基因可能通过与Calcineurin结合调节Calcineurin的活性,共同参与肌细胞内由Ca2+调控的信息传递功能,从而调控其它相关基因的表达,在肌纤维的分化和发育过程中发挥重要的作用。另外,Calsarcin-1与α-actinin、γ-filamin、telethonin等多种结构蛋白质共定位于Z-disc。因此,推测Calsarcin-1对Z-disc结构的形成和稳定起重要作用。为了更好的认识Calsarcin-1基因及其互作蛋白对肌细胞钙离子的调控作用,了解快慢肌纤维的决定和分化的分子机理,本研究采用酵母双杂交筛选技术对Calsarcin-1相互作用蛋白质进行了筛选并对其功能进行了初步研究。主要研究成果如下:1.从pEGFP-N1-CS1荧光表达载体中分离得到Calsarcin-1的编码区,并构建到pGBKT7诱饵表达载体中,获得了能成功表达且无毒性的pGBKT7-CS1诱饵表达载体。2.成功地分离、纯化了猪肌肉组织的双链cDNA,用来表达猎物文库的融合蛋白。3.将诱饵载体、双链cDNA及猎物载体pGADT7-Rec共转化到感受态的酵母细胞中,进行酵母双杂交筛选,初步筛选到与Calsarcin-1相互作用的29个阳性克隆。4.经PCR筛选、酶切、测序和结果分析,获得到3个感兴趣的蛋白（CASQ1、TNNT3和ACTN3）。其中CASQ1和TNNT3参与了肌细胞中对钙离子的调控,ACTN3则参与了维持Z线结构稳定。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 Calsarcins基因家族的研究概述
• 1.2 猪骨骼肌肌纤维分化的调控机制
• 1.2.1 肌纤维的组成和分类
• 1.2.2 骨骼肌纤维类型对猪肉品质的影响
• 1.2.3 钙调神经磷酸酶信号途径与骨骼肌纤维类型形成的关系
• 1.2.4 Calsarcins基因家族在肌纤维类型形成中的作用
• 1.3 酵母双杂交系统
• 1.3.1 酵母双杂交的原理
• 1.3.2 酵母双杂交系统的应用
• 1.3.3 酵母双杂交系统的优缺点
• 1.4 本课题的主要目的和技术路线
• 第二章 诱饵载体PGBKT7-CS1的构建及验证
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 常用试剂及试剂盒
• 2.1.3 常用试剂及培养基的配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 目的片段Calsarcins-1的制备
• 2.2.2 诱饵载体的制备
• 2.2.3 诱饵菌株转录活性及毒性的检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Calsarcin-1基因CDS区的扩增
• 2.3.2 重组质粒的酶切
• 2.3.3 pGBKT7载体酶切
• 2.3.4 诱饵载体酶切
• 2.3.5 酵母菌株AH109的表型验证
• 2.3.6 DNA-BD融合蛋白毒性及转录活性的检测分析
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 猪肌肉双链cDNA的制备
• 3.1 材料
• 3.1.1 猪的组织样品
• 3.1.2 常用试剂及试剂盒
• 3.2 方法
• 3.2.1 猪肌肉总RNA的提取与检测
• 3.2.2 猪肌肉mRNA的分离
• 3.2.3 肌肉文库双链cDNA的合成
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 猪肌肉组织总RNA电泳结果
• 3.3.2 猪肌肉组织mRNA电泳结果
• 3.3.3 双链cDNA的纯化结果
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 酵母双杂交筛选与Calsarcin-1互作的基因
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株、质粒与载体
• 4.1.2 主要试剂盒
• 4.1.3 培养基及配置
• 4.2 方法
• 4.2.1 用共转化方法筛选与Calsarcin-1互作的基因
• 4.2.2 对照菌株的小量转化
• 4.2.3 阳性克隆的筛选与鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 共转化结果
• 4.3.2 菌落PCR鉴定结果
• 4.3.3 AD质粒酶切鉴定结果
• 4.4 阳性克隆测序及序列比对结果
• 4.5 小结与讨论
• 第五章 小结
• 5.1 本实验获得的结果
• 5.2 本实验的创新性
• 5.3 本研究的不足之处
• 5.4 下一步工作计划
• 参考文献
• 致谢
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 攻读学位期间发表文章情况