论文摘要
土壤盐渍化是一个全球性生态问题,是当今世界土地荒漠化和耕地退化的主要因素之一。土地的盐渍化对农业生产和生态环境带来了巨大的负面影响。近年来随着分子生物学的飞速发展,利用转基因技术提高植物的耐盐性越来越受到关注。本论文通过对小麦耐盐基因机制的研究,为今后培育耐盐小麦品种提供理论基础。研究的主要内容为：1.小麦未知基因TaSST的克隆及功能研究通过对小麦耐盐突变体RH8706-49盐胁迫后的基因芯片分析,选取盐胁迫12h后表达升高的Cluster10-30号探针序列,通过电子克隆技术和RT-PCR方法成功克隆到该探针的全长cDNA序列。该基因全长950bp,含有594bp的完整开放阅读框,编码198个氨基酸。经NCBI-Blast比对,该基因是一个假定的蛋白基因,与水稻（Os09g0307300）基因的蛋白同源性为89%,将其命名为TaSST。该基因已登陆Genebank。小麦TaSST基因在盐胁迫后通过实时荧光定量PCR的方法对其相对表达量进行分析,发现TaSST基因在小麦耐盐突变体中受盐、ABA、PEG诱导后表达增强。通过比较TaSST基因在耐盐突变体与敏盐突变体中的表达量,发现TaSST基因在耐盐突变体中的表达量均高于敏盐突变体。以上结果从分子水平验证了TaSST基因与小麦耐盐性的正相关关系。构建植物双元表达载体并转化拟南芥,对获得的纯合体转基因拟南芥植株进行了耐盐性分析。结果显示,经不同浓度的NaCl处理后,过表达小麦TaSST基因的拟南芥种子萌发明显好于对照植株,整体植株存活状态也好于对照,表明TaSST基因参与拟南芥对盐的胁迫响应。构建TaSST-GFP融合蛋白表达载体,通过荧光共聚焦显微镜观察转基因拟南芥根部GFP荧光的分布,以此来确定TaSST蛋白的亚细胞定位。观察结果显示在转基因拟南芥中荧光主要位于细胞膜。由此推测,小麦TaSST蛋白定位于细胞膜上为了确定TaSST基因在非生物胁迫信号通路中的作用,用拟南芥中已知的ADH、FRY1、SOS2、SOS3、SAD1、P5CS、COR15α、RD29B和KIN29个耐盐相关基因,通过实时荧光定量PCR进行定量分析。在过表达TaSST基因的转基因拟南芥中,ADH、P5CS、RD29B和COR15a四个基因表达量明显升高,SAD1、SOS2和SOS3三个基因表达量没有明显的变化,而表达量显著下降的是KIN2和FRY1两个基因。推测TaSST可能位于ADH、P5CS、RD29B和COR15a基因的上游,通过CDPK、ABA、SOS途径参与渗透胁迫的调节。P5CS是脯氨酸合成过程一个关键酶,脯氨酸含量测定结果与信号通路中P5CS的表达量升高相一致。此实验结果进一步证明了TaSST基因与小麦耐盐相关。2.假定膜蛋白基因TaSSA的克隆和功能研究同样的方法成功克隆到盐胁迫12h后表达升高的Cluster2-48号探针的全长cDNA序列。该基因全长915bp,含有699bp的完整开放阅读框,编码233个氨基酸。经NCBI-Blast比对,该基因是一个假定的基因,含有五个跨膜结构域,与水稻（OsI01272）基因的蛋白同源性为78%,将其命名为TaSSA。该基因已登陆Genebank。采用实时荧光定量PCR的方法对小麦TaSSA基因在盐、ABA、PEG胁迫下的相对表达量进行分析,发现胁迫后,TaSSA基因在耐盐突变体中的表达均显著高于在敏盐突变体中的表达,生物信息学预测TaSSA具有TRAM-LAG1-CLN8 superfamil保守结构域。构建TaSSA-GFP融合蛋白表达载体,激光共聚焦显微镜观察结果显示在转基因拟南芥中荧光主要位于细胞膜。由此推测,小麦TaSSA蛋白定位于细胞膜上。构建植物双元表达载体并转化拟南芥,耐盐性分析结果显示：不同盐浓度处理下,过表达TaSSA基因的拟南芥种子萌发得比野生型的早且数量多,幼苗的根长虽然和对照植株基本一致,但侧根数量很多,整体植株生长状态也明显好于对照组,这表明TaSSA基因可能参与拟南芥对盐的胁迫响应,在其中起着正调控的作用。对拟南芥各个胁迫信号通路上已知的一些基因进行定量PCR分析。结果表明：在过表达TaSSA基因的转基因拟南芥中,表达量升高的基因是SOS3、SOS2、KIN2和COR15a；表达量下降的基因是SAD1、ADH、P5CS、RD29B（?）FRY1,推测TaSSA基因可能位于SOS3、SOS2、KIN2和COR15a基因的上游。