苦马豆素单链抗体基因的初步研究

论文摘要

疯草（locoweed）的主要有毒成分吲哚兹定生物碱—苦马豆素（swainsonine,SW）,不仅能导致家畜中毒死亡,而且能够引起母畜流产、不孕、胎儿畸形和公畜不育,给我国草原畜牧业生产造成了巨大的经济损失。从营养学角度看,疯草营养价值高,是一种潜在的牧草资源,其抗逆性强,在恶劣环境中能旺盛生长,应当把它看作生态群落的重要组成部分。如何有效防治疯草对动物的毒性,又可将它作为优质牧草加以利用,一直是人们研究的热点。此外,目前SW的检测方法有薄层层析（TLC）定性分析、气相色谱（GC）和高效液相色谱（HPLC）定量分析。SW与大多数生物碱包括吲哚兹定生物碱和喹诺兹定生物碱不同,对一般检查生物碱试剂显色不灵敏,只有在较高含量时才能用TLC检测到。由于分子结构中缺乏适合分光光度法检测的发色基团,GC和HPLC不太适合SW的检测。因此,寻找一种新的灵敏、便利的检测SW方法也是当务之急。本研究旨在构建SW单链抗体基因,并期望将来能制备出SW特异性单链抗体,用于SW的免疫检测和动物疯草中毒的免疫防治。取得了如下研究结果:1甘肃棘豆草中苦马豆素的提取分离工艺比较研究本研究在前人研究的基础上,采用生物碱提取常用的醇类溶剂热回流法、酸水冷浸法和水提取法3种工艺提取甘肃棘豆草中生物碱,在相同条件下均能分离得到白色针状结晶,经TLC,mp,IR,MS,1HNMR鉴定为SW,平均得率分别为18.61μg/g、12.22μg/g、6.23μg/g。试验结果表明,工业酒精热回流提取的效果最好,总碱得率最高,在相同条件下升华得到的SW也比其它2种提取工艺多,是目前提取SW的一种最为经济简便的工艺。本研究探索出了甘肃棘豆草中SW提取的最优化工艺,成功提取SW 500 mg,为后续的试验研究提供了原料上的保障。2苦马豆素-HSA对小鼠的免疫原性研究12只Balb/c小鼠随机分为A、B、C组,每组4只,A组为小剂量免疫组,B组为大剂量免疫组,C组为对照组。A组编号为A1～A4,B组编号为B1～B4。首次免疫时,福氏完全佐剂乳化SW-HSA,A、B组每只小鼠颈部两侧、背部皮下及后腿内侧5点注射,每点0.04 mL,A组剂量为0.05 mg/只,B组剂量为0.10 mg/只。第30 d,第2次免疫,福氏不完全佐剂乳化SW-HSA,免疫途径、剂量同首次免疫。第50 d,福氏不完全佐剂乳化SW-HSA,相同免疫途径进行第3次免疫,A组剂量为0.075 mg/只,B组剂量为0.15 mg/只。第70 d,生理盐水溶解SW-HSA,背部皮下4点,每点0.04 mL和腹腔注射0.04 mL进行第4次免疫,A组剂量为0.1125 mg/只,B组剂量为0.225 mg/只。第3次免疫后第10 d和第4次免疫后第10 d间接血凝试验（IHA）与间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测SW抗体效价。结果表明,SW-HSA可诱导小鼠产生SW的特异性抗体。第3次免疫后第10 d,IHA测定A1～A4和B1～B4抗体滴度分别为22,21,22,22和23,22,22,22。间接ELISA测定抗体滴度分别为26,25,25,26和27,26,26,26。第4次免疫后第10 d,IHA测定A1～A4和B1～B4抗体滴度分别为27,26,26,26和26,25,25,25。间接ELISA测定A1～A4和B1～B4抗体滴度分别为210,29,210,29和29,28,28,28。经第4次免疫以后,获得了高抗体滴度的免疫小鼠,为构建SW单链抗体基因奠定了基础。3苦马豆素单链抗体基因的构建首先从3只抗体滴度较高的小鼠脾脏中提取出总RNA,逆转录获得cDNA。参考Orlandi等设计的引物,VH上游引物与抗体可变区FR1,Vκ下游引物与抗体可变区FR4互补,VH下游引物3’端和Vκ上游引物5’端和Linker两端互补。设计引物时引进了限制性内切酶位点,既有利于与载体连接,也便于以后可变区基因在原核、真核中的克隆。通过PCR条件的探索,先用通用简并引物扩增出VH、VL基因,用15肽Linker引物对VL基因进行PCR扩增修饰得到VL-Linker,重叠延伸（SOE）反应与VH基因拼接组装成ScFv基因片段。这种先修饰再拼接、扩增的策略,可提高SOE反应的工作效率,避免了非特异性的发生。本研究通过RT-PCR、SOE-PCR扩增出VH、VL、VL-Linker和ScFv基因片段,大小分别约为340 bp、320 bp、420 bp和760 bp,符合预期的要求。本研究利用RT-PCR技术初步构建了SW的单链抗体基因,为后续构建SW噬菌体单链抗体库奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章噬菌体抗体库技术研究进展
• 1.1 噬菌体表面展示技术的原理
• 1.1.1 丝状噬菌体简介
• 1.1.2 噬菌体表面展示技术的原理
• 1.2 噬菌体抗体库技术产生基础
• 1.3 噬菌体抗体库技术的原理
• 1.4 抗体库的发展
• 1.4.1 单域抗体库
• 1.4.2 组合抗体库
• 1.4.3 噬菌体抗体库
• 1.5 噬菌体抗体库的类型
• 1.5.1 天然抗体库
• 1.5.2 免疫抗体库
• 1.5.3 合成抗体库
• 1.6 噬菌体抗体库常用载体
• 1.7 噬菌体抗体库的构建与表达
• 1.7.1 构建噬菌体抗体库的细胞来源
• 1.7.2 噬菌体抗体库的构建途径
• 1.7.3 抗体可变区基因的表达
• 1.8 噬菌体抗体库的筛选
• 1.8.1 特异性噬菌体抗体库的筛选和富集
• 1.8.2 噬菌体抗体库筛选方法
• 1.9 噬菌体抗体亲和力的成熟
• 1.10 噬菌体抗体库技术的优点
• 1.10.1 噬菌体抗体技术已初步具备相当量的库容
• 1.10.2 噬菌体抗体技术无需免疫动物
• 1.10.3 适于大规模工业化生产
• 1.10.4 噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库
• 1.10.5 抗体表型和基因型一致
• 1.10.6 人源性抗体免疫原性低
• 1.10.7 能够得到机体处于正常状态下不易产生的自身抗体
• 1.10.8 噬菌体单链抗体不含Fc 段，分子量小，穿透力强
• 1.11 噬菌体抗体库技术存在的问题
• 1.12 噬菌体抗体库技术的应用
• 1.12.1 在寄生虫学研究领域
• 1.12.2 在肿瘤研究领域
• 1.12.3 在自身免疫疾病的研究领域
• 1.12.4 在输血医学中的应用
• 1.12.5 医学基础性研究
• 1.12.6 医学微生物研究领域
• 1.12.7 在诊断和治疗方面的应用
• 1.12.8 药物靶向治疗方面
• 第二章 单链抗体的研究及其应用研究进展
• 2.1 单链抗体的特点
• 2.1.1 单价单链抗体的特点
• 2.1.2 单链抗体多聚体的特点
• 2.1.3 双特异性单链抗体的特点
• 2.2 单链抗体的分子结构及其生物学特性
• 2.3 单链抗体的基因来源
• 2.4 单链抗体VH与VL的拼接方法
• 2.5 单链抗体基因的连接方式
• 2.6 单链抗体基因的构建
• 2.7 单链抗体的表达载体及噬粒载体PCANTAB-5E
• 2.8 单链抗体的表达系统
• 2.8.1 原核细胞表达系统
• 2.8.2 真核细胞表达系统
• 2.8.3 植物表达系统
• 2.8.4 杆状病毒表达系统
• 2.8.5 哺乳动物表达系统
• 2.8.6 噬菌体表达系统
• 2.9 单链抗体的应用前景
• 2.9.1 基础理论研究
• 2.9.2 研究寄生虫的抗原表位
• 2.9.3 研究自身免疫疾病
• 2.9.4 临床疾病的诊断与治疗
• 2.9.5 细胞内免疫
• 2.9.6 其它
• 试验研究
• 第三章 甘肃棘豆草中苦马豆素的提取分离工艺比较研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 植物样品中生物碱提取结果
• 3.2.2 薄层层析（TLC）检查结果
• 3.2.3 甘肃棘豆总生物碱中苦马豆素分离结果
• 3.2.4 单体化合物结构鉴定结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 苦马豆素的提取
• 3.3.2 甘肃棘豆中苦马豆素的提取研究
• 3.3.3 影响苦马豆素提取率的因素
• 3.4 小结
• 第四章 苦马豆素-HSA 对小鼠的免疫原性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 IHA 试验结果
• 4.2.2 间接ELISA 试验结果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 人工抗原的免疫原性
• 4.3.2 抗半抗原抗体的检测
• 4.4 小结
• 第五章 苦马豆素单链抗体基因的构建
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 免疫鼠血清效价测定及总RNA 的提取结果
• 5.2.2 PCR 扩增VH﹑VL基因及定量结果
• 5.2.3 PCR 加端修饰VL基因结果
• 5.2.4 单链抗体基因（ScFv）的组装结果
• 5.3 讨论
• 5.3.1 RNA 的提取及cDNA 第一条链的合成
• 5.3.2 单连抗体基因的引物设计及PCR 扩增
• 5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介