水稻条纹病毒CP、NS3、SP、NSvc4基因介导的病毒抗性比较研究

论文摘要

水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）引发的水稻条纹叶枯病是一种水稻生产上作用范围广,危害严重的病毒病。RNA介导的病毒抗性是一种转录后基因沉默（Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS）。最新的研究证明发生于不同物种上的RNA沉默的直接引发因子都是双链RNA（double strand RNA）。在转基因植物研究中,dsRNA形成的一条有效途径就是将体外构建的hpRNA结构（hairpin RNA）cDNA引入植物。本研究构建了4个含有RSV不同功能基因发夹RNA（hpRNA）结构的植物表达载体（转录后形成双链RNA）,利用农杆菌介导法转化水稻,对获得转基因植株进行水稻条纹病毒抗性鉴定,比较RSV外壳蛋白基因CP、特异性蛋白基因SP、非特异性蛋白基因NS3及运动相关蛋白基因NSvc4在RNA介导的病毒抗性方面的差异。具体结果如下:1、以RSV的CP、NS3、SP和NSvc4基因3′端的400bp为目的片段,分别反向重复插入到含有经过改造的植物表达载体pCAMBIA-1300’中,构建了发夹结构植物表达载体pPHD-CP、pPHD-NS3、pPHD-SP和pPHD-NSvc4。2、将所构建的植物表达载体pPHD-CP、pPHD-NS3、pPHD-SP和pPHD-NSvc4及空载体pCAMBIA1300’用冻融法导入农杆菌EHA105。菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功正确导入农杆菌中。3、农杆菌介导法转化水稻品种豫粳6号。经卡那霉素对再生植株进行抗性筛选,后经PCR检测,分别获得转pPHD-CP的水稻68株,转pPHD-NS3的水稻70株,转pPHD-SP的水稻57株,转pPHD-NSvc4的水稻58株和转pCAMBIA-1300’的水稻75株。4、以灰飞虱为传毒介体,对上述水稻受体进行常规生物学接毒,并进行了抗病性分析。统计测定结果显示,在转pPHD-CP、pPHD-NS3、pPHD-SP和pPHD-NSvc4的水稻中,RSV抗性植株的比例分别为32.73%、30.00%、38.56%和31.67%。5、Northern blot和siRNA blot分析结果显示,转基因在RNA水平上都得到了表达,目的片段转录产物的积累量与转基因植株的抗病性呈负相关;转基因植株中可以检测到病毒特异siRNA,证明该抗病性是RNA介导的抗病性,即RNA沉默的结果,但抗病性与siRNA的积累量二者并无直接关系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 水稻条纹病毒的分子生物学特性
• 1.1.1 RSV 的基因组结构特点
• 1.1.2 RSV 的转录调控和编码的蛋白
• 1.2 RNA 干扰
• 1.2.1 RNA 干扰现象的发现
• 1.2.2 RNAi 的特点
• 1.3 RNA 介导的病毒抗性
• 1.3.1 概念的提出
• 1.3.2 RNA 介导的病毒抗性的特点
• 1.3.3 RNA 介导的病毒抗性本质是转录后基因沉默
• 1.4 影响RNA 沉默效率的因素
• 1.4.1 发夹结构
• 1.5 不同功能基因对RNA 介导的病毒抗性的影响
• 1.6 立题依据和主要研究内容
• 1.6.1 立题依据
• 1.6.2 主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒源
• 2.1.2 植物受体
• 2.1.3 菌株和质粒
• 2.1.4 常用缓冲液及培养基的配制
• 2.1.5 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物表达载体系统的构建
• 2.2.1.1 目的片段的 PCR 扩增
• 2.2.1.2 目的片段和质粒的酶切和回收
• 2.2.1.3 目的片段和质粒的连接
• 2.2.1.4 感受态细胞的制备
• 2.2.1.5 重组质粒向大肠杆菌中的转化（热激法）
• 2.2.1.6 转化菌落的PCR 鉴定
• 2.2.1.7 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.1.8 质粒DNA 的大量提取（碱裂解法）
• 2.2.2 重组表达载体向农杆菌中的转化（冻融法）
• 2.2.3 农杆菌介导的水稻基因转化
• 2.2.4 水稻总DNA 的提取
• 2.2.5 转基因植株的PCR 检测
• 2.2.6 转基因植物的潮霉素抗性检测
• 2.2.7 水稻总RNA 的提取（Trizol 法）
• 2.2.8 转基因水稻的抗病性分析
• 2.2.9 转基因植株的Northern blot 分析
• 2.2.10 转基因植株siRNA 的提取及杂交分析
• 3 结果与分析
• 3.1 发夹结构植物表达载体构建
• 3.1.1 400bp 目的片段与载体的连接及鉴定
• 3.1.2 片段反向连接的PCR 鉴定
• 3.1.3 重组表达载体的酶切鉴定
• 3.2 重组表达载体向农杆菌中的转化
• 3.3 转基因水稻的获得
• 3.4 转基因水稻的鉴定
• 3.4.1 转基因水稻的 HygB 抗性检测
• 3.4.2 转基因水稻的PCR 检测
• 3.5 转基因水稻的抗病性分析
• 3.6 总 RNA 和siRNA 的 Northern blot 分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士学位论文内容简介及自评