猴源细小病毒的人工感染及免疫预防研究

论文摘要

细小病毒（Parvovirus）是一类在自然界中分布极为广泛的DNA病毒。细小病毒科细小病毒属的主要成员包括犬细小病毒（CPV）、猫泛白细胞减少症病毒（FPV）、貂肠炎病毒（MEV）、阿留申病毒（ADV）等近20种病毒。猴细小病毒（simian parvovirus, SPV）是从有严重贫血的猕猴（cynomolgus monkeys）分离出的一种细小病毒。该病毒感染猴子的临床表现与人类感染人细小病毒B19（B19病毒）的临床表现有许多相似性[1]。本实验室从患有严重传染性腹泻的猴体内分离出一株猴源细小病毒,该毒株感染猴子的临床症状类似犬猫细小病毒性肠炎。VP2基因序列分析表明该病毒VP2基因序列与FPV VP2核苷酸的同源性为98.75%,与CPV VP2核苷酸的同源性为98.15%[2]。猴的感染表明,随着基因突变细小病毒的宿主范围和致病性在不断地在发生着变化,其如何实现跨越种间屏障及其能否跨种感染人类等问题仍不清楚。国内外尚未见到对其进行致病性、宿主范围、抗原性、免疫原性和血清学调查等研究。因此本研究通过分离鉴定获得一株猴源细小病毒;用该毒株分别实验感染对该病毒HI抗体小于1:2的1-2月龄健康家猫、家犬、食蟹猴、雪貂、水貂和荷兰兔各3只,另3只作对照,通过动物感染实验初步确定该分离株的致病性和动物感染范围;同时,为了解细小病毒在我国猴群中的感染情况,对2010年～2011年间收集的来自我国北京地区总计160只圈养猴的血清样品进行了猴源细小病毒HI抗体调查;为了解该猴源细小病毒的抗原性和免疫原性,本研究还研制了该猴源细小病毒的灭活苗并对其进行免疫实验研究。结果证实该病毒分离株为强毒株,可以突破种间屏障,感染猴、家犬和家猫;抗体调查结果显示猴血清的猴源细小病毒HI抗体阳性率为58.1 %,证实细小病毒在我国北京地区圈养猴群中感染比较普遍;免疫实验结果证实该毒株具有较好的免疫原性和抗原性,其灭活苗免疫接种猴能诱导产生抗细小病毒的特异性免疫反应。本研究为进一步确定该病毒分离株的动物感染谱、开展猴源细小病毒的流行病学调查及免疫预防奠定了基础。该病毒分离株是否为FPV或CPV变异株,如何跨种传播给猴并发生致病性突变尚需进一步研究。

论文目录

• 英文缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验一 猴源细小病毒的分离与鉴定
• 1 材料
• 1.1 病料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要器材
• 1.4 细胞与病毒
• 1.5 其它
• 2 方法
• 2.1 病毒分离
• 2.2 样品及分离培养的病毒液中 DNA 的提取
• 2.3 PCR 检测
• 2.4 形态学观察
• 2.5 半数细胞感染量（TCID50）
• 2.6 血凝性实验
• 2.7 VP2 基因扩增和序列分析
• 3 结果
• 3.1 病毒分离
• 3.2 PCR 鉴定
• 3.3 形态学观察
• 3.4 半数细胞感染量（TCID50）
• 3.5 血凝性实验
• 3.6 VP2 基因序列测定与分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 实验二 猴源细小病毒的动物感染谱实验
• 1 材料和方法
• 1.1 病毒和细胞
• 1.2 实验动物
• 1.3 病毒的培养与鉴定
• 1.4 人工感染实验
• 1.5 病理组织学观察与免疫组织化学染色
• 1.6 超微结构观察
• 2 结果
• 2.1 病毒的培养与鉴定
• 2.2 人工感染实验
• 2.3 猴体回归实验
• 3 讨论
• 4 小结
• 实验三 猴血清猴源细小病毒抗体调查
• 1 材料
• 1.1 血清
• 1.2 病料
• 1.3 病毒和细胞
• 2 方法
• 2.1 样品和猪红细胞的处理
• 2.2 HA/HI 基本操作方法
• 2.3 缓冲液体系的选择
• 2.4 缓冲液pH 值的选择
• 2.5 兔血清浓度的选择
• 2.6 猪红细胞浓度的选择
• 2.7 反应温度的选择
• 2.8 阿氏液浓度和保存期限的选择
• 2.9 猴血清细小病毒抗体调查
• 3 结果
• 3.1 缓冲液的选择
• 3.2 缓冲液pH 值的选择
• 3.3 兔血清浓度的选择
• 3.4 猪红细胞浓度的选择
• 3.5 反应温度的选择
• 3.6 阿氏液浓度的选择
• 3.7 猴血清猴源细小病毒抗体调查
• 4 讨论
• 5 小结
• 实验四 猴源细小病毒免疫猴及攻毒保护实验
• 1 材料
• 1.1 病毒和细胞
• 1.2 实验动物
• 1.3 疫苗
• 1.4 主要试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 猴源细小病毒灭活苗的制备
• 2.2 灭活苗的检定
• 2.3 猴免疫实验
• 2.4 猴攻毒保护实验
• 3 结果
• 3.1 病毒的培养和毒力测定
• 3.2 病毒的纯化和鉴定
• 3.3 灭活疫苗的性状、稳定性与安全性
• 3.4 灭活疫苗免疫小鼠血清效价的测定
• 3.5 CPV VP2-CAV2 活载体苗及猴源细小病毒灭活苗对猴的安全性
• 3.6 免疫猴抗猴源细小病毒抗体水平检测
• 3.7 抗CAV-2 抗体检测
• 3.8 免疫猴的外周血淋巴细胞转化试验
• 3.9 攻毒保护实验
• 4 讨论
• 4.1 病毒的纯化
• 4.2 免疫猴体液免疫和细胞免疫水平检测
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 中文综述
• 个人简历
• 致谢