白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CHS基因家族的补充克隆和RNAi功能鉴定

论文摘要

类黄酮（flavonoids）化合物是广泛存在的植物次生代谢物,是植物组织中红色、蓝色、紫色花青素苷（anthocyanins）色素的呈色物质,黄酮醇（flavonols）、黄酮（flavonoids）也是黄色花色等的成色物质,类黄酮中的原花青素（proanthocyanidins, PA）是种皮色素的物质基础。许多类黄酮物质在人体内具有抗氧化、预防肿瘤等生物活性。查尔酮合酶（Chalcone synthase, CHS）是类黄酮途径的第一个关键酶,在植物色素的积累、UV防护、抗菌机制等方面起重要作用。与甘蓝型油菜同属芸薹科的模式生物拟南芥中,因查尔酮合酶基因的功能失活性突变导致种皮颜色由野生型的深褐色变成黄色即透明种皮（transparent testa,tt）,定为tt4。本课题组此前的研究中已从甘蓝型油菜、白菜、甘蓝中分别克隆了8、4、4个CHS全长基因序列,并表明甘蓝型油菜拥有亲本物种白菜和甘蓝的全套CHS基因之中。芸薹属（Brassica）植物是芸薹科（Brassicaceae）芸薹族（Brassiceae）的骨干大属,包括很多油料作物、蔬菜和观赏植物品种,为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜,以及观赏和园艺植物,并为畜牧业提供饲料,具有重要的经济价值。甘蓝型油菜（Brassica napus）是我国和世界最为重要的油料作物之一。黄籽油菜与黑籽油菜相比较,具有种皮色素少、种皮薄、纤维素含量低以及蛋白质和含油量高的优点。通过远缘杂交等方法创造黄籽材料的选育周期长、效率低,尤其是黄籽表型易受环境影响而不稳定。急需阐明黄籽性状机理研究和开展其分子育种。本研究补充克隆了芸薹属物种白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CHS基因家族的剩余成员,对其进行了系统的生物信息学分析和功能比较基因组学分析；采用半定量RT-PCR检测了它们在各个器官中的表达特征,并对3个物种的黑、黄籽材料间CHS基因家族的表达差异进行了半定量RT-PCR检测；构建了芸薹属CHS基因家族的RNAi植物表达载体并转化黑籽甘蓝型油菜品种中双10号；构建了BnCHS、BrCHS和BoCHS基因家族正义植物表达载体。（1）补充克隆了白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CHS基因家族的剩余成员本研究分别从白菜、甘蓝、甘蓝型油菜中补充克隆了CHS基因家族共4条功能基因的全长cDNA和基因组序列,命名为BrCHS5、BoCHS5、BnCHS9、BnCHS10;以及8条假基因的基因组序列,命名为BrCHS6pse、BrCHS7pse、BoCHS6pse、BoCHS7pse、BnCHS11pse、BnCHS12pse、BnCHS13pse、BnCHS14pse。BrCHS5、BoCHS5、BnCHS9、BnCHS10基因组序列全长为1353-1656bp;各含有1个内含子和两个外显子；全长cDNA为1182～1419 bp;ORF均为为1182 bp;5’UTR均为55bp,3’UTR为116～182bp。（2）新克隆BrCHS、BoCHS、BnCHS成员编码蛋白的特征推导的芸薹属3个物种CHS家族所编码的4个CHS蛋白大小为393～395 aa,分子量为43078.53～43176.69Da,等电点为6.09～9.68,全部为酸性蛋白,疏水性氨基酸所占比例最高,其次是极性氨基酸。SignalP和：SOSUI等软件预测它们没有信号肽。PredictNLS和WoLFPSORT预测它们均定位于细胞质。NetPhos2.0预测芸薹属CHS家族蛋白均存在多个显著的磷酸化位点。SOPMA预测芸薹属CHS蛋白的二级结构中α螺旋比例最高,其次为延伸链。（3）从CHS基因分析甘蓝型油菜、白菜、甘蓝之间的进化关系本实验克隆的BnCHS、BrCHS、BoCHS家族10个成员以及本课题组狄曙玲和朱子超同学克隆获得的18个成员与拟南芥AtCHS的全长基因两两比对结果表明,BnCHSl、BnCHS2、BnCHS3、BnCHS4、BnCHS5、BnCH6、BnCHS7、BnCHS8、BnCHS9、BnCHS10、BnCHS11pse、BnCHS12pse、BnCH13se、BnCHS14pse与BrCHS1、BoCHS1、BrCHS2、BoCHS2、BrCHS3、BoCHS3、BrCHS4、BrCHS4、BrCHS5、BoCHS5、BrCHS6pse、BoCHS6pse、BrCHS7pse、BoCHS7pse的一致性分别达到99.1%、99.1%、98.2%、100%、98.9%、100%、99.7%、99.8%、98.7%、99.2%、99.9%、99.9%、99.8%、99.9%。这意味着,甘蓝型油菜的CHS基因家族的1～14号成员可能分别来自BrCHS1、BoCHS1、BrCHS2、BoCHS2、BrCHS3、BoCHS3、BrCHS4、BoCHS4、BrCHS5、BoCHS5、BrCHS6pse、BoCHS6pse、BrCHS7pse、BoCHS7pse,甘蓝型油菜的确是甘蓝和白菜的融合体。BrCHS、BoCHS、BnCHS家族蛋白及AtCHS蛋白的序列比对和系统发生关系同样证明以上结论。本研究还表明,十字花科祖先中具有2条CHS基因,它们在芸薹族祖先中分别发生了“三倍化”加倍,但后来的进化中虽然多数三倍化成员得到了保留,部分成员却已发生了假基因化。（4）白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CHS家族表达的器官特异性采用半定量RT-PCR检测了白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CHS基因家族在典型黑籽材料的12个组织器官中的总体和成员表达,结果表明白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CHS因家族具有相似的器官特异性,在主要的器官中都有表达,而且在生殖器官蕾、花和发育的种子中优势表达,但成员间在器官特异性和表达丰度上显著歧化。（5）CHS表达水平与白菜、甘蓝、甘蓝型油菜黄籽性状的关系半定量RT-PCR检测表明,白菜和甘蓝的黄籽材料生殖器官中CHS因家族的总体表达和各成员的表达水平均比黑籽材料明显下调,但甘蓝型油菜黄籽材料生殖器官中BnCHS基因家族的表达水平与黑籽材料没有明显差别。这说明白菜和甘蓝物种的已有黄籽性状与CHS表达下调有关,但甘蓝型油菜的已有黄籽性状是由于其它位点引起的,与CHS表达下调无关。在芸薹属中,CHS与黄籽性状的关系在不同物种间不同,亲本物中多个CHS基因成员的同时下调也说明黄籽性状的根源是CHS的上游调控信号的问题。（6）RNA干扰揭示的CHS基因家族与芸薹属种皮色素等性状的关系以BnCHS1为模板,克隆了831bp的芸薹属CHS基因家族RNA干扰片段BCHS1,采用Ncol+AatII反义亚克隆到·pFGC5941M的启动子与间隔区之间,采用BamHI+XbaI正义亚克隆到pFGC5941M的间隔区与终止子之间,形成了11814bp的RNA干扰载体pBCHSI,并转化根癌农杆菌菌株LBA4404,获得工程菌株,并采用改良叶盘法转化甘蓝型黑籽油菜中双10号,获得81株再生植株,并从中筛选鉴定得到14株高抗Basta的PCR阳性转基因植株。转基因植株普遍发生了如下性状修饰：一是种皮色素明显减少,种子颜色变浅,外观呈褐色和红褐色,与对照的典型黑色对比明显；二是种子变小,充实度降低,千粒重下降；三是结实率下降,荚果长度变短；四是有效侧枝数变少。表明芸薹属植物中CHS基因家族不仅参与种皮色素性状,而且还可能参与分枝形成、授粉受精、种子发育等性状的形成。（7）构建了芸薹属CHS家族正义植物表达载体将BnCHS、BrCHS、BoCHS基因家族的全长cDNA构建到中间载体pCambia2301M1B中,形成了8个植物表达载体,分别命名为pBnCHSIS、pBnCHS2S、pBnCHS3S、pBnCHS4S、pBnCHS5S、pBnCHS6S、pBnCHS7S、pBnCHS8S,获得了它们的农杆菌工程菌株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 类黄酮
• 1.2 查尔酮合酶
• 1.3 芸薹属简介
• 第2章 引言
• 第3章 材料与方法
• 3.1 植物材料、载体和菌种
• 3.2 试剂和试剂盒
• 3.3 主要仪器设备
• 3.4 植物材料总RNA的提取和纯化
• 3.5 mRNA的反转录
• 3.6 植物材料基因组总DNA的提取和纯化
• 3.7 BnCHS、BrCHS、BoCHS基因的补充克隆
• 3.8 目的片段的亚克隆和测序
• 3.9 BnCHS、BrCHS、BoCHS家族表达的器官特异性检测
• 3.10 BnCHS、BrCHS、BoCHS基因家族在黑、黄籽间差异表达的检测
• 3.11 芸薹属CHS基因家族RNA干扰载体的构建
• 3.12 RNA干扰载体转化黑籽甘蓝型油菜
• 3.13 芸薹属CHS基因家族正义植物表达载体的构建
• 第4章 结果与分析
• 4.1 BnCHS、BrCHS和BoCHS家族的电子克隆
• 4.2 BnCHS、BrCHS和BoCHS家族gDNA的补充克隆
• 4.3 各器官总RNA的提取和反转录
• 4.4 BrCHS、BoCHS、BnCHS家族全长cDNA的补充克隆
• 4.5 BrCHS、BoCHS和BnCHS家族核酸水平的分析
• 4.6 BnCHS、BrCHS、BoCHS家族蛋白的分析
• 4.7 BrCHS、BoCHS、BnCHS基因家族表达的器官特异性
• 4.8 BrCHS、BoCHS、BnCHS家族在黑、黄籽间的表达差异性
• 4.9 CHS基因家族RNA干扰载体的构建
• 4.10 pBCHSI转化黑籽甘蓝型油菜中双10号的研究
• 4.11 CHS家族正义植物表达载体的构建
• 第5章 讨论
• 5.1 CHS位点揭示的芸薹属内种间和与拟南芥属间的进化关系
• 5.2 芸薹属CHS基因家族的器官特异性
• 5.3 CHS与芸薹属黑籽性状和黄籽性状的关系
• 5.4 CHS与芸薹属其它性状的关系
• 5.5 关于芸薹属CHS基因家族的沉默技术
• 第6章 结论
• 6.1 对白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CHS基因家族利假基因进行补充克隆
• 6.2 补充克隆的芸薹属CHS家族成员编码蛋白的特征
• 6.3 CHS位点支持甘蓝型油菜为白菜、甘蓝的异源四倍体物种
• 6.4 白菜、甘蓝、甘蓝型油菜CHS基因家族表达的器官特异性
• 6.5 CHS表达水平与芸薹属已有黄籽性状的关系
• 6.6 RNA干扰揭示的CHS基因家族与芸薹属种皮色素等性状的关系
• 6.7 构建了芸薹属CHS家族正义植物表达载体
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 发表论文及参加课题一览表