重组葡萄球菌肠毒素SEA和SEO单克隆抗体的研制

论文摘要

葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins,SEs）是由葡萄球菌产生的、已超过20种基因型报道的、氨基酸序列和结构相似,具有潜在超抗原活性的一组食源性致病毒素。目前对新发现肠毒素结构、功能活性的认识和不同型肠毒素的检测鉴别尚缺乏有效手段。制备型特异性单抗对认识不同型肠毒素的结构和功能、不同毒素的检测鉴别、分析肠毒素基因簇的表达调控机制等具有重要意义。本研究通过构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）和O（SEO）的原核表达载体,应用纯化的重组葡萄球菌肠毒素制备了两种肠毒素单克隆抗体,并对单抗特性做了研究。应用克隆的肠毒素基因sea、selo构建pET28α原核表达载体,转化重组菌BL21（DE3）表达,经镍鳌合层析纯化获得可溶性重组蛋白SEA-His、SEO-His。应用已构建的pEGX-6P-SEA和pEGX-6P-SEO表达载体转化宿主菌BL21,经诱导表达、亲和层析纯化获得SEA-GST、SEO-GST重组蛋白,以此蛋白为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,3次免疫后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备杂交瘤细胞。以SEA-His、SEO-His为包被蛋白建立间接ELISA方法筛选阳性克隆,阳性率分别为8.5%（34/400）、5.3%（24/450）。有限稀释法对SEA肠毒素阳性杂交瘤细胞4A2,SEO肠毒素阳性杂交瘤细胞5C12、8C7进一步亚克隆,获得稳定分泌抗重组肠毒素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A型:4A2-C5、4A2-B10;O型:5C12-C3、5C12-B4、8C7-G2、8C7-H8。对亚克隆获得的杂交瘤细胞株分泌的单抗特性进行了研究。经间接ELISA检测,4A2-C5、5C12-C3、8C7-G2杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:1600、1:1600、1:6400,腹水效价分别达1:6.4×103、1:5.12×104、1:1.024×105;3株单克隆抗体4A2-C5、8C7-G2、5C12-C3亲和常数分别为3.35×106、1.89×106、1.45×106;亚类鉴定结果显示,4A2-C5、5C12-C3为IgG2b亚类;8C7-G2为IgM亚类。竞争ELISA对单抗识别抗原位点的分析结果表明,5C12-C3和8C7-G2分别识别SEO蛋白的不同抗原表位;Western blotting表明获得的3株单克隆抗体均能识别相应重组蛋白的B细胞线性表位;应用SEB和SEC1肠毒素阳性血清的阻断ELISA结果表明,SEA、SEO、SEB和SEC1肠毒素间存在交叉抗原。通过单抗特异性鉴定,结合肠毒素成熟肽氨基酸比对、表位预测、易接近性预测、二级结构预测分析,推断获得的3株单抗为葡萄球菌肠毒素群特异性抗体。这为葡萄球菌肠毒素功能特性的分析、检测奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 葡萄球菌肠毒素简介
• 1.1.1 葡萄球菌肠毒素的血清型及分类
• 1.1.2 葡萄球菌肠毒素的分子结构
• 1.1.3 葡萄球菌肠毒素的理化性质
• 1.1.4 葡萄球菌肠毒素的催吐活性
• 1.1.5 葡萄球菌肠毒素的超抗原性
• 1.1.6 葡萄球菌肠毒素的应用研究
• 1.2 葡萄球菌肠毒素SEA、SEO 的结构与功能
• 1.2.1 SEA 基因与分子结构
• 1.2.2 SEA 分子的主要功能域
• 1.2.3 SEO 研究进展
• 1.3 展望
• 1.4 制备葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的意义
• 第二章 重组葡萄球菌肠毒素 SEA、SEO 的表达及纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒及宿主菌
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌质粒小抽提-碱裂解法
• 2.2.2 sea 原核表达载体pET28α的构建
• 2.2.3 目的基因的酶切与表达载体的连接
• 2.2.4 连接产物的转化及重组质粒鉴定
• 2.2.5 重组表达质粒的转化
• 2.2.6 重组SEA-His、SEO-His 蛋白的镍螯合纯化
• 2.2.7 重组蛋白SEA-GST、SEO-GST 亲和层析纯化
• 2.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.9 重组蛋白的透析及定量
• 2.3 结果
• 2.3.1 pET28α载体重组质粒鉴定
• 2.3.2 重组肠毒素蛋白的表达与纯化
• 2.4 讨论
• 2.4.1 关于重组肠毒素表达载体的选择
• 2.4.2 重组葡萄球菌肠毒素的纯化
• 2.5 小结
• 第三章 重组肠毒素 SEA、SEO 单克隆抗体的制备及鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 重组蛋白、细胞及实验动物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 细胞培养用溶液
• 3.1.4 单克隆抗体制备相关试剂及配制
• 3.1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）相关溶液
• 3.1.6 免疫印迹试验用试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 免疫及筛选用重组肠毒素抗原
• 3.2.2 小鼠免疫
• 3.2.3 单克隆抗体制备筛选用间接ELISA 方法的建立
• 3.2.4 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2.5 单克隆抗体的大量制备
• 3.2.6 单克隆抗体的鉴定及特性分析
• 3.2.7 肠毒素表位的预测及分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 间接ELISA 的建立
• 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立
• 3.3.3 单抗识别表位分析
• 3.3.4 杂交瘤细胞上清及腹水中单克隆抗体效价
• 3.3.5 免疫印迹（Western blotting）试验
• 3.3.6 阻断ELISA 试验
• 3.3.7 单克隆抗体亲和常数测定
• 3.3.8 单克隆抗体类型鉴定
• 3.3.9 肠毒素单抗特性的预测及分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 应用重组葡萄球菌肠毒素制备特异性单克隆抗体
• 3.4.2 作为超抗原葡萄球菌肠毒素单抗制备的特殊性
• 3.4.3 关于葡萄球菌肠毒素单克隆抗体制备的特异性及复杂性
• 3.4.4 关于单克隆抗体的鉴定
• 3.4.5 关于单克隆抗体制备过程
• 3.5 小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录1：主要仪器设备
• 附录2：主要化学试剂
• 附录3：缩略词表
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢