论文摘要
在核移植过程中，供核细胞与受体胞质是重构胚的两个重要构件，尤其是受体胞质对重构胚核基因的重新编程及胚胎的发育至关重要。目前，大多数研究者都是采用MⅡ期卵母细胞作为受体胞质。但是该方法由于在去核时要抽取大量胞质，而且还要用紫外线照射以检查去核是否完全，因而对细胞损伤大影响重构胚的发育。近年来有人采用激活MⅡ期卵母细胞待其排出第二极体后，抽取第二极体及其周围少量含核的胞质来达到去核的目的，又称为TⅡ期去核。这种方法由于抽取的胞质少，而且不需要紫外线的照射，故而对细胞的损伤较小。许多实验室对该方法进行了研究，但是关于卵母细胞TⅡ期去核对猪体细胞核移植重构胚发育的影响，目前国内还尚无相关报道。本论文主要研究和比较了猪卵母细胞TⅡ期去核方法与效果，在此基础上还对猪卵母细胞TⅡ期去核法生产核移植胚胎的程序进行了优化，为推广应用该技术生产猪的体细胞核移植胚胎提供一些数据和经验。本实验在原有猪体细胞核移植技术的基础上，对影响猪卵母细胞TⅡ期去核重构胚发育的几个因素（卵母细胞预激活程序、核移植后核质作用时间以及核供体细胞预处理方法）进行如下实验。1、猪卵母细胞TⅡ期预激活物质的选择。本实验以第二极体排出比率为指标，分别选择不同浓度的三种物质，作用于猪成熟卵母细胞观察统计预激活效果。5％、7％和10％乙醇浓度预激活猪卵母细胞排出第二极体的比率分别为20.83％（25/120）、25.00％（30/120）和22.50％（27/120）；采用浓度为4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL和10μg/mL的放线菌酮预激活猪卵母细胞后，第二极体的排出率分别为：16.67％（20/120）、19.17％（23/120）、25.83％（31/120）和20.83％（25/120）；浓度为5μmol/mL、10μmol/mL、15μmol/mL和20μmol/mL钙离子载体A23187（CaA）预激活猪卵母细胞后第二极体的排出效果为54.17％（65/120）、58.33％（70/120）、64.17％（77/120）和57.50％（69/120），15μmol/mL组效果最好，各浓度之间差异不显著（p＞0.05）。比较以上三种物质预激活猪卵母细胞的效果发现15μmol/mL的CaA极显著优于其他两种物质（p＜0.01）。2、不同受体卵母细胞胞质对猪体细胞核移植的影响。本实验以重构胚卵裂率和4-细胞以上胚胎发育率为检测统计指标，以MⅡ期中期去核和TⅡ期去核的卵母细胞作为受体胞质，经血清饥饿的卵丘细胞作为核供体构建重构胚胎，比较两种受体胞质对猪体细胞核移植效果的影响。结果表明：MⅡ期中期去核的卵母细胞为核受体胞质的卵裂率和4-细胞以上胚胎发育率均高于TⅡ期去核的卵母细胞（31.67％vs24.17％,14.17％vs10.83％），差异显著（p＜0.05）。说明，MⅡ期中期去核的卵母细胞更适宜作为核移植受体胞质。3、不同核质作用时间对猪体细胞核移植的影响。采用电融合法将卵丘细胞移入去核的卵母细胞中，供体细胞在TⅡ期去核的受体胞质内分别孵育0h、1h、2h、3h、4h和5h后，1.3kV/cm、80μs、单次脉冲电激活重构胚，以重构胚卵裂率和4-细胞以上胚胎发育率为检测统计指标，比较不同核质孵育时间对核移植效果的影响。结果表明：核质孵育4h可以获得较好的核移植效果，其卵裂率（35.83％（45/120））显著高于其他几组（22.50％、25.83％、26.67％、28.83％、30.83％，p＜0.05）。4-细胞以上胚胎发育率与孵育3h组差异不显著（12.50％vs12.50％,p＞0.05）。但与其它几组相比差异显著（12.50％vs 4.17％,9.17％,10.00％，7.50％,p＜0.05）。说明用TⅡ期去核卵母细胞作为核受体胞质，核质孵育4h后再进行补充性电激活可以提高猪体细胞核移植重构胚的发育率。4、不同供核细胞预处理方法对核移植效果的影响。本实验将经过血清饥饿处理的卵丘细胞作为对照组，分别用7％乙醇和钙离子载体A23187（5μmol/L）预处理供核细胞，核移植重构胚融合后，核质孵育4h再激活，比较两种预处理方法对核移植重构胚的影响。结果表明：用CaA预处理组的核移植重构胚的卵裂率（37.50％vs30.83％）和4-细胞以上胚胎发育率（15.83％vs10.83％）均高于对照组，差异显著（p＜0.05）。卵裂率也略高于乙醇预处理组的核移植重构胚卵裂率（37.50％vs34.16％，p＞0.05），但是4-细胞以上胚胎发育率显著高于乙醇预处理组（15.83％vs9.17％，p＜0.05）。由此可见，TⅡ期去核的卵母细胞作为核受体胞质，用钙离子载体预处理核供体细胞，核质孵育4h再激活重构胚，有利于核移植重构胚的发育。综上所述，在以TⅡ期去核的猪卵母细胞作为核受体胞质时，最适宜的程序是：用浓度为15μmol/mL钙离子载体处理卵母细胞5min，然后抽取第二极体及其周围少量胞质进行去核。供核细胞用5μmol/mL钙离子载体预处理后注入TⅡ期去核的猪卵母细胞卵周隙内，采用参数为1.0kV/cm、80μs、单次脉冲电融合法移入供体细胞核，构建重构胚胎，此后，核质孵育4h，最后使用参数为1.3kV/cm、80μs、单次脉冲电激活重构胚，可以明显提高核移植重构胚的发育比率。简化核移植的操作程序。