肺癌抗体靶向治疗与新型工程抗体药物的研究

论文摘要

肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,靶向治疗已在临床肺癌治疗中显示出较传统化疗更令人满意的疗效,已成为目前肺癌研究的热点。为了给肺癌的靶向治疗提供潜在的新的候选靶标和靶向治疗新药,本研究的第一部分通过制备、筛选、鉴定具有抑制抗肺癌功能的鼠单克隆抗体,再用质谱技术反向鉴定其靶抗原蛋白,发现了新的肺癌靶向治疗靶标MYH9,并研究了该蛋白对于肺癌细胞生长转移的作用和初步机制。采用自行建立的基于功能性单克隆抗体库和功能差异细胞模型的免疫蛋白质组学技术,从含2893个杂交瘤单抗的抗肺癌单克隆抗体库中筛选出候选的抗肺癌功能性单抗33株。对其中的1株IgG1类的单抗23C2进行了深入的研究。通过活细胞免疫荧光亚细胞结构定位及活细胞流式细胞术证实单抗23C2所识别的抗原在多种肺癌细胞系中均有表达,并可部分转位于细胞膜表面；对60例肺癌病人癌组织及配对正常组织进行免疫组化检测的结果证明,单抗23C2的靶抗原在85%的人肺癌组织中特异性地上调表达。采用共接种模型进行23C2单抗的体内抑瘤实验,结果证明23C2单抗可以显著抑制人肺癌移植瘤的生长,抑瘤率达73.7%。以上结果表明抗肺癌功能性单抗23C2的靶抗原在肺癌中特异上调表达,并在肺癌生长中起了重要作用,具有成为肺癌治疗靶标的潜力。运用免疫亲和层析和MALDI-TOF-PMF质谱技术,鉴定23C2单抗所识别的抗原为220KD左右的非肌性肌球蛋白重链ⅡA（NMHC IIA，MYH9）:并进一步采用基因敲降、免疫共沉淀和细胞免疫荧光共定位等多种方法证明了单抗23C2识别的抗原确为MYH9。采用MYH9的商业化抗体检测肺癌细胞及120例肺癌及正常组织,结果显示MYH9在88.2%的肺癌组织中上调表达,并可表达于细胞膜上,与单抗23C2的检测结果一致。随后,本研究应用单抗23C2体外处理肺癌细胞和RNAi技术敲降MYH9基因表达,分析了体外干扰阻断MYH9对肺癌细胞增殖、黏附、侵袭、迁移以及细胞周期的作用。结果显示,单抗23C2阻断MYH9可抑制肺癌细胞体外生长,抑制率达23.3%；可抑制肺癌细胞迁移,抑制率达23.15%,但对细胞周期、黏附和侵袭均未观察到明显的影响。RNAi技术敲降肺癌细胞A549中MYH9基因的表达后,A549细胞形态明显改变；细胞在Matrigel基质上的生长受到显著抑制,抑制率达68.2%；细胞与胞外基质FN、Matrigel和Collagen I的黏附能力显著下降,分别降低22.76%、30.78%、55.12%,细胞体外迁移和侵袭能力显著下降,分别下降了39%-53%和38.3%。这些研究结果证明,MYH9在体外具有促进肺癌细胞生长、与胞外基质黏附、迁移和侵袭的重要功能。为了进一步探讨MYH9促进肺癌细胞生长、黏附、迁移和侵袭的作用机制,检测了敲降MYH9基因后对A549细胞周期变化的影响,发现虽然细胞周期无显著变化,但诱导了A549细胞发生凋亡,这可能是敲降MYH9基因后A549细胞生长受到显著抑制的原因之一;同时采用免疫荧光染色技术发现,敲降MYH9基因后围绕于A549细胞周边对于细胞运动非常重要的黏着斑显著减少,F-actin骨架蛋白排列紊乱,提示MYH9可能参与了黏着斑蛋白复合物的形成,并影响收缩运动微丝的形成,从而促进肺癌细胞的黏附、迁移和侵袭。以上研究结果表明,MYH9具有作为肺癌靶向治疗的一个新的功能性分子靶标的重要潜力。力达霉素（LDM）是一种超强细胞毒性化疗药物,但同时产生的毒副作用限制了其临床应用。为此,本研究第二部分首次在真核细胞中构建并高效表达了基于LDM的抗体靶向型药物——抗人CEA小分子抗体融合蛋白,以期克服其毒副作用大的缺陷。采用基因工程重组技术,将抗CEA嵌合抗体Rch24的小分子抗体F（ab’）2重链C-末端通过接头与LDM的辅基蛋白LDP连接,构建了Rch24 F（ab’）2-LDP抗体融合蛋白重链基因,再将其连接入真核高效表达载体,与原有抗CEA小分子抗体F（ab’）2轻链表达载体一起,构成了完整的抗人CEA小分子抗体-LDP融合蛋白的真核高效表达载体系统。将轻重链表达载体同时导入真核细胞CHO中,经MTX3×10-8M加压后,实现了抗人CEA小分子抗体-LDP融合蛋白的高效表达,产量可达16μg/ml。培养上清中的表达产物经Western boltting鉴定具有正确的分子量,直接ELISA检测证明该抗体融合蛋白具有与CEA抗原结合的活性,活细胞免疫荧光检测证明该抗体融合蛋白具有特异与肿瘤细胞膜表面CEA抗原结合的活性。这些结果表明我们所获得的抗体融合蛋白表达产物具有正确的分子结构和良好的生物学活性。综上所述,本研究通过制备筛选具有抑制抗肺癌功能的鼠单克隆抗体并反向鉴定其靶抗原蛋白的技术,首次报道发现了1个新的可表达于细胞膜上,并在人肺癌组织中特异表达的肺癌靶向治疗功能性分子靶标MYH9,证明其具有促进肺癌细胞生长、黏附、迁移和侵袭的重要功能,为肺癌靶向治疗提供了新的重要候选靶标；首次构建了抗人CEA嵌合小分子抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白并在真核哺乳动物细胞CHO中实现了高产量表达,表达产物具有良好的生物活性,为肺癌等CEA阳性肿瘤的抗体靶向治疗提供了一种高效低毒的新的候选药物。

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图表索引

英文缩略词

中文摘要

Abstract

第一部分肺癌抗体靶向治疗--肺癌功能性抗体及分子靶标的研究

前言

一、材料与方法

（一）实验材料

1. 细胞系

2. 组织标本

3. 动物

4. 主要试剂及耗材

5. 主要仪器

6. PCR引物

7. 分析软件

（二）实验方法

二、结果

1. 肺癌功能性单抗的筛选与鉴定

1.1 肺癌功能性抗体库的制备与初筛

1.2 功能性单克隆抗体23C2类和亚类的测定

1.3 功能性单克隆抗体23C2所识别抗原在肺癌细胞中的表达

1.3.1 细胞免疫荧光检测肺癌杂交瘤单抗23C2对人肺癌细胞系的识别

1.3.2 细胞免疫荧光检测肺癌杂交瘤单抗23C2识别抗原的亚细胞定位

1.4 功能性单克隆抗体23C2所识别抗原在肺癌组织中的表达

1.5 功能性单克隆抗体23C2体内抑制肺癌移植瘤

2. 功能性单抗识别功能性抗原的分离鉴定

2.1 功能性单抗的纯化

2.2 优化与筛选提取单抗识别抗原的方法与功能性抗原的分子量鉴定

2.3 亲和层析纯化抗原蛋白

2.4 抗原蛋白的质谱分析鉴定

2.5 单克隆抗体23C2抗原基因的鉴定

2.5.1 基因敲降验证23C2抗原基因

2.5.2 免疫共沉淀验证23C2抗原基因

2.5.3 细胞免疫荧光共定位验证23C2抗原基因

2.5.4 细胞免疫荧光验证23C2抗原基因

3. 商业化抗体检测MYH9在肺癌组织中的表达

4. 抗体体外处理体外功能的研究

4.1 抗体体外处理后对肺癌细胞增殖的影响

4.2 抗体体外处理后对肺癌细胞与基质粘附的影响

4.3 抗体体外处理后对肺癌细胞侵袭的影响

4.4 抗体体外处理后对肺癌细胞迁移的影响

4.5 抗体体外处理后对肺癌细胞细胞周期的影响

5. siRNA瞬时敲降肺癌抗原的功能性基因对肺癌细胞体外功能的影响

5.1 抗原基因敲降效率的检测

5.2 抗原基因敲降后对肺癌细胞增殖的影响

5.3 抗原基因敲降后对肺癌细胞与基质黏附的影响

5.4 抗原基因敲降后对肺癌细胞侵袭的影响

5.5 抗原基因敲降后对肺癌细胞迁移的影响

5.5.1 划痕实验分析抗原基因敲降后对肺癌细胞迁移的影响

5.5.2 Transwell分析抗原基因敲降后对肺癌细胞迁移的影响

5.6 抗原基因敲降后对肺癌细胞细胞周期的影响

5.7 抗原基因敲降后对细胞贴壁形态的影响

5.8 抗原基因敲降后对细胞黏着斑蛋白和actin骨架蛋白的影响

三、讨论

小结

第二部分抗CEA小分子抗体融合蛋白的构建与表达

前言

一、材料与方法

（一）实验材料

1. 细胞系

2. 菌株

3. 质粒

4. 主要试剂

5. 主要仪器

6. 克隆引物

7. 计算机分子软件

（二）实验方法

二、结果

2-LDP抗体融合蛋白重链基因Rch24F（ab'）₂Fd-LDP真核高效表达载体的构建'>1. Rch24F（ab'）₂-LDP抗体融合蛋白重链基因Rch24F（ab'）₂Fd-LDP真核高效表达载体的构建

2Fd和LDP的扩增'>1.1 Rch24F（ab'）₂Fd和LDP的扩增

2Fd克隆载体的构建'>1.2 Rch24F（ab'）₂Fd克隆载体的构建

2Fd-LDP中间克隆载体的构建'>1.3 Rch24F（ab'）₂Fd-LDP中间克隆载体的构建

2Fd-LDP高效表达载体的构建'>1.4 Rch24F（ab'）₂Fd-LDP高效表达载体的构建

2Fd-LDP高效表达载体的酶切鉴定和序列分析'>1.5 pSRDC-Rch24F（ab'）₂Fd-LDP高效表达载体的酶切鉴定和序列分析

2-LDP在CHO细胞中的高效表达'>2. 抗体融合蛋白Rch24F（ab'）₂-LDP在CHO细胞中的高效表达

2-LDP高效真核表达载体转染CHO-dhfr^-细胞'>2.1 抗体融合蛋白Rch24F（ab'）₂-LDP高效真核表达载体转染CHO-dhfr^-细胞

2-LDP在CHO细胞中的高效表达'>2.2 抗体融合蛋白Rch24F（ab'）₂-LDP在CHO细胞中的高效表达

2-LDP分子量的鉴定'>3. 抗体融合蛋白Rch24F（ab'）₂-LDP分子量的鉴定

2-LDP生物学活性的鉴定'>4. 抗体融合蛋白Rch24F（ab'）₂-LDP生物学活性的鉴定

2-LDP与抗原结合的活性'>4.1 直接ELISA检测抗体融合蛋白Rch24F（ab'）₂-LDP与抗原结合的活性

2-LDP的结合活性'>4.2 活细胞免疫荧光检测抗体融合蛋白Rch24F（ab'）₂-LDP的结合活性

三、讨论

小结

文献综述

参考文献

致谢

附录

个人简历

基金资助情况

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论文摘要

论文目录

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