来源于节杆菌的β-D-半乳糖苷酶的克隆表达及其酶学性质的研究

论文摘要

嗜冷菌能在严酷的环境中生存使得人们对此类菌非常感兴趣。为了适应低温环境,其本身能产生一些低温酶。其中,β-D-半乳糖苷酶具有很大的商业利用前景。据调查,世界上有大约十分之一的人,在乳糖代谢方面存在着问题。通常,我们称之为乳糖不耐受症。这一部分人群因其自身缺乏β-D-半乳糖苷酶,在饮用牛奶时,因乳糖造成身体不适,出现腹泻,呕吐等不良反应。因此,在牛奶的加工工艺上,目前主要采取直接添加乳酸菌（双歧杆菌）或添加β-D-半乳糖苷酶的方法来将牛奶中的乳糖降解。而低温β-D-半乳糖苷酶具有在不破坏牛奶原有风味的情况下降解乳糖的优点。本实验室分离到一株产β-D-半乳糖苷酶的低温菌命名为ON14,并且着重对其是否产低温β-D-半乳糖苷酶进行分析,结果表明ON14存在两种β-D-半乳糖苷酶基因分别命名为β-GalⅠ（3090bp）β-GalⅡ（2052bp）通过序列比对分析,发现β-GalⅠ属糖苷水解酶第二家族。β-GalⅡ属lacG家族,它们的最适酶活温度分别是5℃和37℃。因β-GalⅠ良好的低温酶活性。我们对其进行外源表达并进行纯化,纯化后β-GalⅠ添加到牛奶中。HPLC检测结果表明,其乳糖降解效果明显,具有很好的商业利用价值。β-GalⅠ,β-GalⅡ作为胞质内β-D-半乳糖苷酶,我们猜测这组同工酶可能在ON14碳源代谢中起不同的作用。RT-PCR的结果表明当乳糖作为唯一碳源时,在不同的温度下,ON14将选择不同的β-D-半乳糖苷酶降解乳糖。在Arthrobacter属中,这是首次报道不同温度将诱导不同的β-D-半乳糖苷酶同工酶进行差异表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 乳糖及低聚半乳糖的概述
• 1.1.1 乳糖
• 1.1.2 低聚半乳糖
• 1.2 β-D-半乳糖苷酶
• 1.2.1 β-D-半乳糖苷酶简介
• 1.2.2 β-D-半乳糖苷酶的研究概况
• 1.2.3 β-D-半乳糖苷酶的催化机理
• 1.2.4 β-D-半乳糖苷酶的底物
• 1.2.5 β-D-半乳糖苷酶的来源及其特性
• 1.2.6 高温乳糖酶
• 1.3 低温β-D-半乳糖苷酶
• 1.3.1 低温β-D-半乳糖苷酶产生菌的分离鉴定
• 1.3.2 低温β-D-半乳糖苷酶的酶学性质
• 1.3.3 低温β-D-半乳糖苷酶的结构
• 1.3.4 低温β-D-半乳糖苷酶的人工进化
• 1.3.5 乳糖酶的应用
• 1.4 本论文研究目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 ON14小片段文库的构建及分析
• 3.1.1 ON14小片段文库的构建
• 3.1.2 β-D-半乳糖苷酶同工酶序列分析比对
• 3.1.3 β-D-半乳糖苷酶同工酶粗酶活分析
• 3.1.4 β-D-半乳糖苷酶同工酶在不同温度诱导下的差异表达
• 3.2 低温β-D-半乳糖苷酶β-GalⅠ的分析研究
• 3.2.1 β-GalⅠ序列分析
• 3.2.2 β-GalⅠ诱导表达以及纯化及酶学性质研究
• 3.2.3 纯化后的β-GalⅠ对牛奶中乳糖降解的研究
• 4 讨论
• 4.1 β-D-半乳糖苷酶来源及分类
• 4.2 β-D-半乳糖苷酶的低温诱导
• 4.3 β-GalI的结构模拟及活性位点分析
• 4.4 β-GalI应用探讨
• 5 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录