农杆菌介导的Bt、CBF1基因对马铃薯的遗传转化

论文摘要

本研究以马铃薯品种东农303的脱毒微型薯为外植体，利用农杆菌介导法分别将Bt-Cry V基因和CBF1基因转入马铃薯中，经PCR和PCR-Southern检测证明Bt-CryV基因和CBF1基因已转入马铃薯中。同时对影响遗传转化因素激素种类与浓度、蔗糖和琼脂浓度、脱菌抗生素种类与浓度、共培养时间、筛选方式等进行了研究，优化了马铃薯再生体系和遗传转化体系。主要研究结果如下：1薯块再生培养基确定为MS+ZT 3.5mg／L+IAA 1.0mg／L，出芽率为89.85％。以经过三个月休眠期的薯块为最佳外植体生理状态，基本培养基中蔗糖和琼脂浓度分别为30g／L，0.7％。2利用农杆菌介导法进行遗传转化时的最适条件受所转入的目的基因影响不大，两种基因最适的农杆菌侵染时间均为5min、菌液浓度均为OD600=0.5，此条件下的出芽率分别为61.90％和68.33％，污染率较低。3共培养时间受目的基因活性影响较大，东农303薯块与CryV基因与薯块的最佳共培养时间为60h，CBF1基因与薯块的最佳共培养时间为36h。4对不同产地脱菌抗生素的浓度进行了比较试验，国产头孢噻肟钠（哈药）对CryV基因和CBF1基因的有效抑菌浓度分别为400mg／L、500mg／L。选用进口头孢噻肟钠（invitrogen）抑菌效果较好，且在有效的抑菌浓度下对外值体无不良影响，它对CryV基因和CBF1基因的有效抑菌浓度均为150mg／L。5试验采用的筛选方式为延迟7d筛选，抗性选择剂为卡那霉素（Kan），结果表明薯块芽诱导阶段Kan浓度为100mg／L，生根阶段的Kan浓度为100mg／L。6目的基因CryV试验共获得68株kan抗性植株，其中21株通过了生根筛选（Kan100mg／L），PCR检测结果表明有10株呈阳性，进一步的PCR-Southern杂交检测结果呈阳性。目的基因CBF1试验总共获得96株kan抗性植株，其中31株通过了生根筛选（Kan100mg／L），PCR检测结果表明有15株呈阳性，进一步的PCR-Southern杂交检测结果呈阳性。证明了目的基因已整合到了马铃薯基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 根癌农杆菌介导的植物基因转化的研究进展
• 1.2.2 基因工程技术在马铃薯育种中的应用
• 1.2.3 Bt基因的基因工程研究进展
• 1.2.4 转录因子CBF1的基因工程研究进展
• 1.2.5 转基因植物的安全性评价
• 1.2.6 技术路线图
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 农杆菌培养基
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 马铃薯再生体系的建立
• 2.2.2 遗传转化系统的优化
• 2.2.3 农杆菌转化方法及菌种保存
• 2.3 转化体的筛选与鉴定
• 2.3.1 筛选方式和时间的确定
• 2.3.2 选择压力的确定
• 2.3.3 PCR检测
• 2.3.4 PCR-Southern杂交（地高辛法）
• 3 结果与分析
• 3.1 马铃薯再生体系的建立
• 3.1.1 薯块再生培养基的确定
• 3.1.2 蔗糖和琼脂浓度的确定
• 3.1.3 微型薯休眠期的确定
• 3.2 遗传转化影响因素的探讨
• 3.2.1 农杆菌浓度及侵染时间对遗传转化的影响
• 3.2.2 共培养时间对遗传转化的影响
• 3.2.3 头孢噻肟钠（Cef）对遗传转化的影响
• 3.3 转化体的筛选与鉴定
• 3.3.1 筛选方式和时间的确定
• 3.3.2 选择压力的确定
• 3.3.3 PCR检测
• 3.3.4 PCR-Southern杂交
• 4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 图版
• 图版说明
• 攻读学位期间发表的学术论文