八棱海棠与水稻AP2/EREBP类转录因子的克隆及功能分析

论文摘要

植物在其整个生活周期中，无时不处于变化着的环境中。干旱、高盐和低温是诸多非生物逆境中对作物危害最为严重的自然灾害，长期以来，人们都非常关注对这种非生物胁迫的研究。通常在逆境条件下，植物能感知、传递逆境胁迫信号，诱导相关功能基因的表达，在生理生化上作出适应性响应。而转录因子在植物逆境信号传递，相关功能基因的表达调控及发育阶段的调控中发挥着关键作用。AP2／EREBP类转录因子是一类调控植物发育且与植物胁迫抗性相关的转录因子，目前拟南芥和水稻中与干旱、高盐和低温相关的AP2／EREBP类转录因子研究得比较深入。其中，DREB和ERF类转录因子可能参与了生物胁迫和非生物胁迫。但对于苹果等木本植物的相关研究还鲜有报道。因此从八棱海棠中克隆类似的转录因子将具有重要的理论意义和现实意义。本研究中利用水稻作为一种模式植物以顺式调控元件DRE和ERE为诱饵，通过“酵母单杂交”的方法从水稻cDNA文库中筛选获得了能够与ERE序列特异性结合的转录因子OsAP25和能够与DRE序列特异性结合的转录因子OsDREB1A并分别对其进行生物信息学分析和逆境环境下的表达分析。根据氨基酸序列的同源性和序列的结构特征，除了OsDREB1A基因，所克隆到的OsAP25基因是还未见报道的新基因。OsAP25转录因子基因的核苷酸序列分析表明，该基因含有1035bp的开放阅读框（ORF），推测编码345个氨基酸，蛋白质分子量为36.4kDa，等电点（pI）为5.54。它也具有ERF类转录因子的典型结构特征，N-端和C-端富含酸性氨基酸，推测为转录激活区；C-端有一个富含碱性氨基酸区推测为核定位信号区（NLS）；在C-端还有一个特有的MAP位点作为激活区；中间是由58个氨基酸组成的保守的DNA结合域（ERF结构域），其第13位和18位分别为丙氨酸（A）和天冬氨酸（D）。根据拟南芥DREB类基因序列和水稻基因组序列比对后，得到5个相似序列，设计简并引物，利用RACE方法从八棱海棠cDNA库中扩增出编码AP2／EREBP蛋白的基因MrDREB2A。根据核苷酸推测的氨基酸序列分析显示，所编码的蛋白具有DREB转录因子的一些典型特征：由58个氨基酸组成的AP2结构域中含有第13位的缬氨酸（V）和第18位的亮氨酸（L）。进一步分析发现，MrDREB2A属于DREB（A-6亚族）类转录因子。利用RT-PCR分别分析了OsAP25和MrDREB2A基因的表达特性。试验结果表明，OsAP25基因的转录依赖于ABA，受干旱、高盐和低温的诱导，而乙烯也微弱地激活了OsAP25基因的转录表达；MrDREB2A基因受到高盐、低温和干旱的诱导，对ABA也有强烈的响应。组织表达特异性检测表明，OsAP25在叶和根中转录水平很高，在茎中较低；MrDREB2A在叶中表达较高，在根和茎中的表达量略低。综上所述，DREB和ERF转录因子的克隆为改良作物的抗逆性提供了候选基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 前言
• 第一章 植物抗逆性及相关转录因子的研究进展
• 1.植物对逆境应答的分子机制
• 1.1 抵抗渗透胁迫中直接起作用的物质
• 1.1.1 LEA蛋白
• 1.1.2 渗透调节物质
• 1.1.3 抗氧化酶系统
• 1.2 植物转录因子在逆境胁迫中的作用
• 1.2.1 转录因子的概念
• 1.2.2 转录因子的结构
• 1.2.3 转录因子的活性调控
• 1.2.4 逆境信号传导过程中的转录因子
• 2 植物抗逆相关转录因子的研究进展
• 2.1 bZIP类转录因子
• 2.2 MYC/MYB类转录因子
• 2.3 AP2/EREBP转录因子家族的特征、分类和功能
• 2.3.1 DREB类转录因子
• 2.3.2 ERF类转录因子
• 3.RACE技术的研究进展
• 3.1 RACE技术原理
• 3.2 几种常见的RACE技术
• 3.2.1 锚连接RACE
• 3.2.2 RNA连接酶介导RACE
• 3.2.3 抑制性RACE
• 3.2.4 环化的第一链cDNA介导的RACE
• 3.3 RACE技术在植物基因分离中的应用
• 3.4 RACE步骤的改良
• 3.4.1 提高反转录效率
• 3.4.2 提高PCR扩增产物的特异性
• 3.4.3 引物设计
• 3.4.4 应用简并引物
• 3.4.5 5′RACE产物的克隆
• 4.目前已克隆到的一些果树基因
• 5.本研究的研究目的及其研究内容
• 5.1 立题依据
• 5.2 技术路线
• 第二章 水稻ERF类转录因子OsAP25的克隆及表达分析
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株及质粒
• 1.1.3 化学试剂、酶制剂及试剂盒
• 1.1.4 培养基及溶液
• 1.1.5 引物
• 2.实验方法
• 2.1 顺式作用元件的合成
• 2.2 质粒的构建
• 2.3 酵母操作技术及质粒转化
• 2.4 DNA操作
• 2.5 生物信息学分析
• 2.6 植物材料处理
• 2.7 RNA的提取
• 2.8 反转录合成cDNA第一链
• 2.9 半定量RT-PCR分析
• 2.9.1 模板cDNA的相对定量
• 2.9.2 OsAP25基因的PCR扩增
• 3.结果与分析
• 3.1 植物顺式调控元件ERE2-cis的合成
• 3.2 水稻编码ERF结合蛋白的cDNA的筛选
• 3.3 OsAP25 cDNA核苷酸及推测的氨基酸序列分析
• 3.4 OsAP25同源性分析
• 3.5 OsAP25二级结构分析
• 3.6 OsAP25表达模式分析
• 4.讨论
• 第三章 八棱海棠DREB类转录因子MrDREB2A的克隆及表达分析
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株及质粒
• 1.1.3 仪器及设备
• 1.1.4 试剂盒及购买的试剂
• 1.1.5 自配的主要试剂
• 1.1.6 PCR引物
• 2.实验方法
• 2.1 RACE cDNA文库的构建
• 2.1.1 CTAB法抽提八棱海棠不同处理苗RNA
• 2.1.2 RNA纯化
• 2.1.3 从八棱海棠mRNA合成第一链cDNA
• 2.2 目的基因保守结构域的获得
• 2.3 目的片段回收,克隆,鉴定及测序
• 2.3.1 凝胶电泳条带的柱层析回收
• 2.3.2 DNA回收片段与pMD18-T Vector的连接
• 2.3.3 大肠杆菌感受态DH5α的制备
• 2.3.4 DNA与pMD18-T Vector的连接产物转化DH5α感受态
• 2.3.5 转化重组载体后的DH5α单菌落培养和碱法小量提取质粒DNA
• 2.3.6 引物合成、转化重组子的鉴定、测序
• 2.4 3’RACE
• 2.5 5’RACE
• 2.6 生物信息学分析
• 2.7 植物材料处理
• 2.8 总RNA的抽提（CTAB法）
• 2.9 总RNA中基因组DNA的去除
• 2.10 反转录合成cDNA第一链
• 2.11 实时定量PCR分析
• 2.11.1 模板cDNA的相对定量
• 2.11.2 MrDREB2A PCR扩增
• 3.结果与分析
• 3.1 八棱海棠总RNA的抽提
• 3.2 八棱海棠MrDREB2A保守结构域的获得
• 3.3 3'RACE
• 3.4 5’RACE
• 3.5 MrDREB2A cDNA核苷酸及预测的氨基酸序列分析
• 3.6 MrDREB2A同源性分析
• 3.7 MrDREB2A二级结构分析
• 3.8 MrDREB2A表达模式分析
• 4.讨论
• 总结与讨论
• 1.结论
• 2.讨论
• 参考文献
• 致谢