欧典螺旋霉素的组分优化

论文摘要

本文首先将菌株经NTG-微波复合诱变处理,同时基于欧典霉素菌株代谢途径,选用前体酸作为欧典螺旋霉素菌株筛因子,使用琼脂块培养法进行初筛,最后经摇瓶发酵复筛,得到了较好的菌株,效价提高了7%-17%,其中一株诱变株NMH0.6-6,组分也得到优化,UNK2从5.73%降为5.22%,UNK4从1.92%降为1.42%,杂质B从0.53%降为0.49%,杂质D基本去除,主要组分SPMⅠ也由86.48%提升为91.63%。本实验基于原有配方,研究过程中补入金属离子的生产工艺,旨在不降低发酵产量的同时优化发酵组分,先通过缺项法分析各个培养基组分对欧典螺旋霉素杂质的影响,筛选出对主要杂质影响显著的金属离子,然后利用全谱直读等离子体发射光谱仪测定发酵过程中显著金属离子的含量变化,确定最优添加时间,再进行最陡爬坡实验和中心组合响应面优化,得到组合添加Co2+,Zn2+的最优添加浓度。即在96h同时添加硫酸锌0.07g/100mL,氯化钴0.016g/100mL。添加后,效价由19384U/mL提高到22587U/mL,提升幅度为16%,杂质B的含量由0.64%下降至0.23%,变化较为显著。通过优化种子培养基和种子培养时间,控制种子生产水平,最后得出,将原一级种子配方直接由原二级配方替代,解决了种子生长不旺盛,批次间种子生产水平波动大的问题。种子最优的培养时间为,一级48h,二级26h。另外通过加入甲基化试剂,加强甲基化作用,降低该相关杂质的含量。首先从诸多甲基化试剂中筛选出最优添加剂氯化胆碱,采用单因子设计实验优化添加时间和添加量,最后将摇瓶中得到的优化条件上罐放大,各主要杂质组分的含量都得到了一定得优化,其中杂质UNK4的含量变化显著,由对照罐的2.11%降至1.18%,其他杂质UNK2由6.57%降至6.35%,杂质B有1.17%降至0.55%,对应的有效组分的含量也有85.56%提升至89.98%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 螺旋霉素的概述
• 1.1.1 螺旋霉素的结构
• 1.1.2 螺旋霉素的应用
• 1.1.2.1 螺旋霉素的作用机理
• 1.1.2.2 抗菌作用
• 1.1.2.3 临床应用
• 1.1.2.4 药代动力学
• 1.2 螺旋霉素生物合成
• 1.2.1 螺旋霉素生物合成途径的研究方法
• 1.2.2 螺旋霉素的生物合成
• 1.2.2.1 大环内酯糖苷配基的生物合成
• 1.2.2.2 大环内酯糖类的生物合成
• 1.2.3 螺旋霉素生物合成过程中的中间代谢产物以及副产物
• 1.3 螺旋霉素发酵的影响因素
• 1.3.1 变温控制
• 1.3.2 溶氧
• 1.3.3 钱离子
• 1.3.4 缬氨酸和脂肪酸
• 1.3.5 诱变育种
• 1.4 课题简介
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 摇瓶发酵
• 2.2.2 螺旋霉素发酵液效价的化学测定法
• 2.2.5 管碟法测生物效价
• 2.2.6 发酵液糖氮含量的测定
• 2.2.7 发酵液组分的测定
• 2.2.8 发酵液有机酸的测定
• 第3章 欧典螺旋霉素高产菌株的推理选育
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 培养方法
• 3.2.4 诱变试剂的制备
• 3.2.5 诱变方法
• 3.2.6 筛选方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 诱变效应的研究
• 3.3.2 前体酸作为欧典螺旋霉素菌株筛选剂的推理选育
• 3.4 诱变结果
• 3.4.1 复筛
• 3.4.2 筛选菌株的传代稳定性研究
• 3.4.3 筛选菌株的HPLC分析
• 3.5 结论
• 第4章 金属离子对欧典螺旋霉素组分的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 培养方法
• 4.2.4 发酵液中ATP的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 用缺项法筛选培养基中对杂质影响显著的金属离子
• 4.3.2 发酵过程中金属离子含量的变化
• 4.3.3 利用最陡爬坡法逼近最优水平
• 4.3.4 中心组合响应面设计实验
• 4.3.5 响应面验证实验
• 4.3.6 组合添加两种金属离子对发酵过程的影响
• 4.3.7 细胞ATP浓度的测定
• 4.4 小结
• 第5章 欧典螺旋霉素生产工艺的优化
• 5.1 引言
• 5.2 种子培养基的优化
• 5.2.1 优化前发酵
• 5.2.2 优化方案的制定
• 5.2.3 优化条件的确定
• 5.2.4 种子培养时间的确定
• 5.3 甲基化试剂对欧典螺旋霉素发酵的影响
• 5.3.1 甲基化试剂对欧典螺旋霉素发酵的影响
• 5.3.2 氯化胆碱对欧典螺旋霉素发酵的影响
• 5.3.3 上罐放大
• 5.3.3.1 实验方法
• 5.3.3.2 结果与讨论
• 5.4 小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢