问号钩端螺旋体对体外培养的吞噬和非吞噬细胞株的不同感染的研究

论文摘要

钩端螺旋体（简称钩体）是细长、螺旋状的细菌,分为致病性的问号钩体（Leptospira interrogans）（至少十二种）和腐生性的双曲钩体（Leptospira biflexa）（至少四种）两大类。钩端螺旋体病（Leptospirosis,简称钩体病）则是由致病性钩体引起的全世界传播的人兽共患病,我国也是钩体病的主要流行疫区之一。人类通常由于职业或者驯养等原因直接或通过被污染的水或土壤间接接触带菌动物的尿液,由此,钩体通过小伤口甚或完整的皮肤粘膜进入人体,经血液循环系统播散到肺,肝,肾等器官。因个体免疫水平的差异及受染菌株的不同,钩体病临床表现轻重不一,典型者出现严重的以黄疸、结膜充血和肾衰为特征的Weil’s综合症。动物感染钩体后通常不发病,而成为无症状携带者,其肾小管中的钩体可随尿液脱落而污染环境。因此宿主的肾脏带菌状态是钩体病持续和流行的一个非常关键的核心环节。为了进一步了解钩体的侵袭性及其肾脏生存,在本研究中,我们选取HEK293、J774A.1、和COS-7等三株代表性的细胞和强毒力的问号钩体赖株作为研究对象,对钩体感染的细胞进行一系列的透射电镜,免疫荧光显微镜,激光共聚焦显微镜观察及western blot分析。我们的结果表明强毒力的问号钩体赖株能在不影响细胞紧密连接（紧密粘连蛋白1）的情况下穿入HEK293细胞；而腐生型的双曲钩体则不能主动穿过而是被HEK293细胞吞噬形成吞噬体,并伴有紧密粘连蛋白1表达量的下降及密度的降低。我们还发现强毒力的问号钩体赖株能以菌体一端或两端黏附于J774A.1细胞,其中大约80%黏附的钩体被吞噬形成吞噬体；含钩体的吞噬体能在胞内进一步成熟并与晚期内体/溶酶体共区域化；此外,透射电镜结果显示含钩体的吞噬体的成熟过程符合Desjardins等提出的"kiss-and-run"机制。此外,我们发现黏附到COS-7细胞的强毒力的问号钩体赖株只有大约40%能被吞噬形成吞噬体,吞噬体内的钩体后来似乎能从吞噬体逃逸/被释放到胞浆中呈游离状态。尽管一副完整的有关钩体致病因子的图画仍需绘制,我们的实验结果一定程度上验证了钩体的侵袭性在其致病中的作用,揭示了钩体在吞噬细胞内的转归/结局,探索了钩体在肾脏细胞中的寄居生存,为进一步研究如何预防钩体病以及如何切断钩体传染源控制钩体的传播提供了理论参考。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 目次
• 1 绪论
• 1.1 钩端螺旋体
• 1.1.1 钩端螺旋体及钩端螺旋体病
• 1.1.2 钩体的致病机制
• 1.2 吞噬体的成熟-八仙过海,各显神通
• 1.2.1 吞噬:从细胞质膜到溶酶体
• 1.2.2 胞内寄生物的生存机制
• 1.3 研究目标
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 化学试剂和培养基
• 2.1.2 抗体
• 2.1.3 消耗品
• 2.1.4 仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 微生物学实验
• 2.2.2 细胞生物学实验
• 2.2.3 钩端螺旋体对细胞的感染
• 2.2.4 免疫学实验
• 2.2.5 分子生物学实验
• 3. 实验结果
• 3.1 强毒力问号钩体赖株引起J774A.1细胞的早期凋亡率明显低于Vero细胞
• 3.2 强毒力问号钩体赖株对不同的细胞有不同的的黏附模式及黏附动力学
• 3.3 透射电镜观察不同的钩体对不同细胞的感染
• 3.3.1 钩体与人胚肾上皮细胞（HEK293细胞）的相互作用
• 3.3.2 问号钩体赖株在单核巨噬样细胞（J774A.1细胞）内的进展-从吞噬体的形成到降解
• 3.3.3 问号钩体在肾成纤维细胞（COS-7细胞）中的进展-从吞噬体内群集到胞浆内游离
• 3.4 含问号钩体赖株的吞噬体与LAMP1的共区域化
• 3.5 间接免疫双荧光技术对黏附与内化钩体的鉴别观察
• 3.6 免疫荧光染色观察问号钩体赖株及腐生型双曲钩体PatocI对HEK293细胞ZO-1蛋白表达的影响
• 3.7 Western Blot检测问号钩体赖株及腐生型双曲钩体PatocI对HEK293细胞ZO-1蛋白表达的影响
• 4 讨论
• 4.1 问号钩体赖株对肾上皮细胞的侵袭-钩体的能动性与其致病
• 4.2 单核巨噬样细胞对问号钩体赖株的吞噬和降解-"kiss-and-run"机制?
• 4.3 问号钩体赖株在肾脏成纤维细胞中的生存
• 4.4 本研究的局限和创新
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及研究成果