壳聚糖衍生物对角膜细胞生长影响的研究

论文摘要

角膜移植是目前治疗角膜盲的有效方法,但是面临着角膜供体严重缺乏、术后发生免疫排斥反应等问题。随着组织工程技术的发展和进步,组织工程角膜为角膜缺损修复开辟了崭新的治疗前景。组织工程研究的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体,关键是生物支架材料的选择和细胞的体外培养。迄今为止,被用作组织工程角膜支架的材料有胶原、羊膜、脱细胞角膜基质、纤维蛋白、壳聚糖等,但材料各有缺点,制约了其发展应用。壳聚糖是一种天然聚阳离子生物多糖,具有可降解性和无毒副作用等性能,在组织工程角膜中已有较多的研究和应用。但其生物相容性不能满足眼内植入的需要,限制了其深入研究。改性化的壳聚糖作为角膜组织工程支架材料的研究,其生物相容性方面会大大优于壳聚糖,但随着材料在体内的逐步降解,产生的小分子量壳聚糖衍生物对角膜细胞的影响也将是评价材料安全性和功能性的一个重要研究内容。本课题以壳聚糖为基本材料,通过化学修饰改性和酶法降解制得多种壳聚糖衍生物,依次开展了理化性质测定、细胞毒性评价及材料的角膜细胞相容性评价,为角膜支架材料的生物安全性提供理论依据。本实验取得以下几个方面的成果和进展：1.以壳聚糖为原料,经本实验室化学制备工艺,向壳聚糖分子中引入小分子功能基团,改变壳聚糖的原有分子结构,制得四种在组织工程角膜中研究较多的水溶性壳聚糖衍生物（羧甲基壳聚糖、羧甲基甲壳质、羟乙基壳聚糖和羟丙基壳聚糖）,后经壳聚糖酶降解形成寡糖（羧甲基壳寡糖、羧甲基甲壳寡糖和壳寡糖）,并制得了单糖（N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖盐酸盐）,对材料进行必要理化性质的测定。采用显微观测和MTT相结合的方法测定了多种糖材料的细胞毒性,证明材料均无细胞毒性,且羧甲基甲壳质、羟乙基壳聚糖、羧甲基甲壳寡糖和壳寡糖能促进L929细胞生长和增殖,为材料的后续应用实验提供了理论支持。2.采用常规组织贴壁法体外培养兔角膜上皮细胞,获得大量活性较高的细胞,为材料的细胞评价提供大量的细胞来源。采用显微观测和MTT相结合的方法测定了糖材料对角膜上皮细胞生长的影响,结果表明四种高分子多糖（羟乙基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羧甲基甲壳质）对角膜上皮细胞生长无毒性,且羟乙基壳聚糖和羧甲基甲壳质对上皮细胞生长有良好的促进作用,提示四种水溶性壳聚糖衍生物可安全用作角膜上皮支架材料。其降解生成的低分子量氨基糖对角膜上皮细胞的生长也无毒性,且羧甲基甲壳寡糖和壳寡糖能明显地促进上皮细胞的生长增殖,提示二者可用作角膜上皮细胞体外培养的培养基添加物。3.体外培养获得大量较高活性的角膜基质细胞,经细胞评价试验,结果显示9种壳聚糖衍生物材料对角膜基质细胞生长均无毒性,提示材料具有良好的细胞相容性。低分子量氨基糖N-乙酰氨基葡萄糖、壳寡糖、羧甲基甲壳寡糖和多糖硫酸软骨素、羧甲基甲壳质均能促进基质细胞的生长增殖,提示N-乙酰氨基葡萄糖、壳寡糖、羧甲基甲壳寡糖可用于角膜基质细胞的体外培养。硫酸软骨素和羧甲基甲壳质用作角膜支架材料起支撑作用的同时还能促进细胞的生长增殖,有利于角膜的缺损修复和重建。实验制备的多种壳聚糖衍生物材料均可安全用于组织工程角膜研究,为后续组织工程角膜的研究提供了必要的理论支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文章综述
• 第一节 组织工程化角膜支架研究进展
• 1.1 组织工程概述
• 1.2 组织工程化角膜支架材料概述
• 1.3 不足
• 第二节 壳聚糖在组织工程角膜中的应用
• 第三节 角膜细胞体外培养的研究现状
• 本课题研究的目的和意义
• 第二章 壳聚糖衍生物的制备、纯化、性质测定和细胞毒性评价
• 1 材料与仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2. 材料的制备与纯化
• 2.1 CM-CTS、CM-CT、HE-CTS、HP-CTS的制备与纯化
• 2.2 寡糖的制备与纯化
• 2.3 甲壳单糖的制备与纯化
• 3 材料性质的测定
• 4 材料的细胞毒性评价
• 5 结果与讨论
• 6 本章小结
• 第三章 壳聚糖衍生物对兔角膜上皮细胞生长影响的研究
• 1. 材料与仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 角膜上皮细胞的原代培养
• 2.2 角膜上皮细胞的传代培养
• 2.3 材料对角膜上皮细胞生长的影响
• 2.4 数据分析
• 3.结果与讨论
• 4 本章小结
• 第四章 壳聚糖衍生物对角膜基质细胞生长影响的研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 角膜基质细胞的原代培养
• 2.2 角膜基质细胞的传代培养
• 2.3 材料对角膜基质细胞生长的影响
• 2.4 数据分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 原代角膜基质细胞形态
• 3.2 各组角膜基质细胞形态观察
• 3.3 糖材料对角膜基质细胞生长的影响
• 4 本章小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 在学期间发表的学术论文与研究成果