抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒3’UTR的猪microRNA体外筛选

论文摘要

MicroRNA（miRNA）是一类可以调节基因表达的小分子单链RNA,广泛参与生物体内各类生物学过程的调节。miRNA主要通过与靶mRNA的3’端非翻译区（3’-untranslated region, 3’UTR）互补配对抑制基因表达。很多研究发现,miRNA在病毒感染过程中也发挥着重要的调节作用。很多病毒编码的miRNA可以顺式或反式调节宿主细胞的基因表达,而细胞编码的miRNA也可以正向或负向调节病毒的基因表达和复制。目前,还没有关于猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV）感染与miRNA调节相关的报道。为探讨猪miRNA在PRRSV感染中的作用,本研究对抑制PRRSV 3’UTR的猪microRNA（miRNA）进行体外筛选。1.猪miRNA在PRRSV 3’UTR靶标的预测。从miRBase（miRBase 15.0, 2009）数据库获得76条猪miRNA序列,采用生物信息学预测在PRRSV 3’UTR可能存在靶作用位点的猪miRNA,预测软件包括miRanda、RNAhybrid、RNA22（microRNA target detection）,获得3条具有潜在靶标的miRNA（ssc-miR-323、ssc-miR-105-1、ssc-miR-105-2）。分析选择ssc-miR-323和ssc-miR-105-1进行人工合成。2.构建PRRSV 3’UTR的双荧光素酶报告基因表达载体。培养Marc-145细胞,增殖PRRSV毒株（NVDC-JXA1）。从GenBank获得JXA1 3’UTR序列（登录号EF112445）,设计引物,提取病毒RNA,扩增3’UTR序列,构建到双荧光素酶报告基因载体psiCHECKTM-2中,经测序鉴定证实构建成功双荧光素酶重组载体psiCHECK-UTR。3.共转染猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）验证miRNA功能。将人工合成的miRNA及其抑制物分别与psiCHECK-UTR共转染SUVEC细胞,利用发光分析法检测双荧光素酶活性,并计算分析相对发光比率。结果发现,ssc-miR-323与psiCHECK-UTR共转染后,荧光比率没有下降,与其抑制物共转染后,荧光比率没有升高;ssc-miR-105-1与psiCHECK-UTR共转染后,荧光比率降低,与其抑制物共转染后,荧光比率恢复。因此,初步判定ssc-miR-323对PRRSV 3’UTR没有抑制作用, ssc-miR-105-1对PRRSV 3’UTR有微弱的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 抑制病毒复制增殖的microRNA 及其靶标识别研究进展
• 1.1 miRNA 的生物学发生机制
• 1.2 miRNA 的序列进化及保守性和特异性研究
• 1.3 miRNA 与靶标作用研究
• 1.4 病毒miRNA 对病毒增殖作用研究
• 1.4.1 病毒miRNA 对病毒基因组靶标作用研究
• 1.4.2 病毒miRNA 对宿主基因组靶标作用研究
• 1.5 宿主miRNA 在病毒感染中的作用研究
• 1.5.1 宿主细胞miRNA 对流感病毒感染作用研究
• 1.5.2 宿主细胞miRNA 对HIV 感染作用研究
• 1.6 miRNA 与PRRSV 研究现状
• 1.7 miRNA 带来的新思考和新挑战
• 试验研究
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒3’非编码区双荧光素酶报告载体的构建与纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器与设备
• 2.1.2 质粒载体与菌株、毒株
• 2.1.3 工具酶及主要试剂
• 2.1.4 细胞系
• 2.1.5 主要实验试剂制备
• 2.1.6 主要分析软件与数据库
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 Marc-145 细胞的培养方法
• 2.2.3 PRRSV 病毒的培养与增殖
• 2.2.4 RT-PCR 反应与检测
• 2.2.5 PRRSV 3’UTR 的克隆载体及双荧光素酶重组载体的构建
• 2.2.6 无内毒素重组质粒的大量提取与纯化
• 2.3 结果
• 2.3.1 PRRSV 毒株在Marc-145 细胞上的增殖与细胞病变
• 2.3.2 PRRSV 病毒的RT-PCR 检测
• 2.3.3 PRRSV 3’UTR 的PCR 扩增
• 2.3.4 PRRSV 3’UTR 克隆载体的双酶切鉴定
• 2.3.5 PRRSV 3’UTR 的双荧光素酶重组载体的酶切鉴定和PCR 鉴定
• 2.3.6 重组质粒的无内毒素大提浓度和纯度检测
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪miRNA 的初步筛选
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 细胞系与质粒
• 3.1.4 生物信息学预测软件及数据库
• 3.2 方法与步骤
• 3.2.1 生物信息学方法预测在PRRSV 3’UTR 上存在靶标的猪miRNA
• 3.2.2 猪脐静脉血管内皮细胞的培养
• 3.2.3 重组质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞
• 3.2.4 转染组细胞的双荧光素酶活性检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 生物信息学预测在PRRSV 3’UTR 有潜在靶标的猪miRNA
• 3.3.2 共转染双荧光素酶检测结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词及中英文对照
• 致谢
• 个人简介