非血缘HLA不全相合双份脐血移植植入动力学的基础研究

论文摘要

背景与目的脐血造血干细胞是良好的造血干细胞（haematopoietic stem cell, HSC）来源,但脐血中含有的HSC数量相对不足从而限制了其在成人中的应用。使用双份脐血混合移植治疗白血病获得成功,激起人们对其相互作用机制的研究。研究证实,接受双份脐血移植的患者,大部分患者长期造血重建的仅来源于一份脐血,而另一份脐血在植入早期即被排斥,但是双份脐血移植的植入动力学的机制目前尚无定论,推测双份脐血中的淋巴细胞与优势份脐血的产生相关。探讨双份非血缘脐血移植用于恶性血液病植入动力学的规律和临床疗效。实验方面将双份脐血的CD34+细胞与CD3+细胞混合培养,观察CD3+细胞对CD34+细胞的增殖分化有无影响。方法临床上选择21例恶性血液系统恶性疾病行非亲缘双份脐血移植的患者为观测对象,使用复合扩增荧光标记短串联重复序列（STR-PCR）结合毛细管电泳技术,动态检测DUCBT受者移植后脐血植入情况,统计与植入可能相关的各项数据。实验中建立液体和半固体培养体系,将免疫磁珠分选纯化的双份脐血的CD34+细胞和CD3+细胞混合培养6天和14天。以流式细胞计数观测CD34+细胞培养后的分化指标（CD33,CD41,CD71）;计数集落形成单位（GM-CFU、BFU—E、GEMM-CFU）分析CD34+细胞的增殖情况。结果1.脐血移植植入情况18/21例DUCBT获得造血重建,中性粒细胞绝对计数（ANC）>0.5×109/L的中位时间为移植后20（14～35）天,血小板>20×109/L的中位时间为移植后34.5（25～49）天。经STR-PCR技术检测显示17/18例受者形成单份脐血的优势植入。非优势份脐血输注的有核细胞总数（total nucleated cell,TNC）,CD34+细胞数和CD3+细胞数为2.17×107 NC/Kg （0.96-3.98×107 NC/kg） , 1.16×105CD34+/Kg （0.36–2.70×105 CD34+/Kg）与1.71×106CD3+/Kg （0.40 - 10.65×106 CD3+/kg）,优势份脐血此两项分别为2.34×107 NC /Kg （1.87-4.45×107NC/kg）,1.15×105CD34+/Kg（0.08–4.00×105CD34+/Kg）和3.225×106 CD3+/Kg(0.51-13.92×106CD3+/kg,差异不具有显著性（P=0.718,0.936,0.073）。2.液体共培养后各份CD34+细胞表面分化指标的变化脐血CD34+细胞分选富集的纯度为（98.5±0.92）%。3天实验组和对照组的各项分化指标无差异（P>0.05）;6天的CD33、CD71实验组明显低于对照组,而CD41明显高于对照组（P<0.05）。3.半固体共培养后CD34+细胞增殖能力的变化实验组的红系集落形成单位（BFU—E）及粒单细胞集落形成单位（GM-CFU）数低于对照组（P<0.05）,混合细胞集落形成数（GEMM-CFU）与对照组无差别（P>0.05）。结论1.双份脐血移植安全有效,应用前景广阔。TNC和CD3+细胞数可能与优势份脐血的产生无相关;2.将两份脐血的CD34+细胞和CD3+细胞体外混合培养对CD34+细胞的增殖分化能力有影响,推测双份脐血间的相互作用可部分的通过CD3+细胞介导。

论文目录

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• 正文
• 1. 前言
• 1.1 异基因造血干细胞移植的重要作用和存在的问题
• 1.2 脐血造血干细胞移植
• 1.2.1 脐血造血干细胞移植的特点
• 1.2.2 脐血造血干细胞移植存在的问题
• 1.2.3 双份脐血移植的研究现状
• （一）非血缘双份脐血移植治疗恶性血液病植入动力学的研究
• 2 临床资料
• 2.1 对象
• 2.1.1 患者的选择
• 2.1.2 脐血的选择
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 预处理方案
• 2.2.2 GVHD的预防
• 2.2.3 双份脐血输注
• 2.2.4 支持治疗
• 2.2.5 植入证据
• 2.2.6 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 造血功能重建
• 3.2 植入动力学与 STR-PCR
• 3.3 优势植入与非优势植入份特点
• 3.4 移植相关并发症与随访生存情况
• （二）双份脐血间CD34+细胞与 CD3+细胞相互作用对分化增殖能力的影响
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 脐血CD34+细胞和CD3+细胞分选试剂
• 2.1.2 CD34+细胞与 CD3+细胞共培养体系
• 2.1.3 流式细胞仪检测试剂
• 2.1.3.1 脐血 CD34+细胞黏附分子的表达以及各系分化
• 2.1.3.2 阴性对照抗体
• 2.1.3.3 流式细胞检测剂
• 2.1.3.4 磷酸盐缓冲液（PBSE）
• 2.1.3.5 细胞固定液
• 2.1.4 实验耗材和设备
• 2.2 实验步骤和方法
• 2.2.1 脐血 CD34+细胞制备
• 2.2.2 脐血 CD3+细胞的制备
• 2.2.3 双份脐血 CD34+细胞与 CD3+细胞体外液体培养体系
• 2.2.4 流式细胞术分析各组 C D 3 4 + 细胞纯度以及各系分化的情况
• 2.2.5 双份脐血 CD34+细胞与 CD3+细胞体外半固体培养体系
• 2.2.6 集落计数分析各组 CD34+细胞集落形成情况
• 2.2.7 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 脐血 CD34+细胞和 CD3+细胞分离纯化
• 3.2 单份脐血 CD34+细胞和异份 CD3+细胞混合培养结果
• 3.3 单份脐血 CD34+细胞与异份 CD3+细胞混合培养过程中 CD34+细胞表面各项分化指标的比例变化
• 3.4 单份脐血 CD34+细胞与异份 CD3+细胞半固体培养后集落计数
• 4. 讨论
• 4.1 双份脐血造血干细胞移植的现状
• 4.2 双份脐血移植的临床应用与提示
• 4.3 CD3+淋巴细胞对脐血干细胞植入的影响
• 4.4 干细胞分化和增殖情况分析
• 4.5 双份脐血相互作用可能的机制分析
• 5. 结论
• 6. 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献