论文摘要
研究目的器官移植是目前治疗各种脏器终末期功能衰竭的最有效手段。但是移植后的急性排斥反应（AR）仍然是移植术后的主要并发症,也是导致慢性排斥反应（CR）和移植器官功能丧失的最重要的危险因素。如何快速诊断和及时治疗急性排斥反应一直是临床器官移植研究的热点。目前临床上诊断急性排斥反应的主要方法包括移植受者临床表现、血液相关指标检测、移植器官病理学活检和影像学辅助检查等,其中活检组织病理学检查仍然是诊断移植排斥反应的最可靠手段,但其侵入性、潜在并发症及取样误差,限制了其临床应用。器官移植排斥反应涉及范围广泛,免疫学机制复杂,迄今为止仍未发现公认的、无创伤性高敏感性和特异性的监测指标。因此,寻找新的非创伤性侵入性监测指标,早期、有效监测移植排斥反应,在移植器官功能发生损害之前及时做出诊断就成为移植免疫学领域亟待解决的问题。分子影像学（molecular imaging）是将分子生物学技术和现代医学影像学相结合而产生的一门新兴的边缘学科,是运用影像学手段显示组织水平、细胞和亚细胞水平的特定分子,反映活体状态下分子水平变化,对其生物学行为在影像方面进行定性和定量研究的科学。经典的影像诊断（CT、MRI等）主要显示的是一些分子改变的终效应,具有解剖学改变的疾病；而分子影像学通过发展新的工具、试剂及方法,探查疾病过程中细胞和分子水平的异常,在尚无解剖学改变前检出异常,为探索疾病的发生、发展和转归,评价药物的疗效,为分子水平疾病的治疗奠定实验和理论基础。应用分子影像学技术研究器官及组织移植术后的免疫学细胞及分子水平的变化,有可能为临床监测移植排斥反应提供重要手段。急性排斥反应的分子影像学信息对于移植术后免疫抑制剂的个体化应用、功效评价、危险因素监测与评估,具有极其重要的指导意义。免疫应答可以分为固有免疫和适应性免疫两大类。前者是指与生俱来的机体天然抵抗力。后者是指接触抗原后机体产生的特异性免疫力。移植排斥反应是一个复杂的免疫学过程,众多免疫分子参与其中。固有免疫是机体免疫系统的重要组成部分,随着对移植免疫机理的深入研究,人们逐渐意识到在移植排斥反应过程中,固有免疫并不仅仅发挥非特异吞噬、清除作用,它与适应性免疫一样能够正确区分“自己”和“非己”,并进一步调控适应性免疫。在器官移植的不同阶段,固有免疫与适应性免疫系统之间都存在着复杂的密不可分的联系。因此选择在固有免疫和适应性免疫中均发挥作用的标志分子,研究其在同种移植排斥过程中的表达状态,探索其能否成为监测移植排斥反应的靶点分子,对于深入阐明移植排斥分子机理,指导临床监测排异反应,更有效地防治移植排斥具有重要的理论和实际意义。移植物进入机体后,移植物抗原致敏机体免疫细胞,被激活的免疫细胞进而产生多种细胞因子,引起免疫排斥反应,由于细胞因子通常在排斥反应早期即被释放,因此可作为移植排斥反应分子影像学的靶分子。已有研究者尝试将放射性核素123I或111In标记的MHCII类分子,99mTc标记的MCP-1 （Monocyte Chamotactic Protein）用于移植排斥反应的分子影像学诊断,但由于所选显像剂特异性不高且在体内清除缓慢,影响了其在临床上的应用。巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）是具有多种生物活性的可溶性淋巴因子,由活化的T细胞、巨噬细胞和其它多种细胞分泌,是免疫和内分泌系统的重要介质,具有激活巨噬细胞、抑制其游走、激活T细胞并增强其功能的作用,在急性炎症和迟发型超敏反应中有重要意义。近年来已有研究表明MIF是同种移植排斥过程中的重要介质,MIF表达的上调与巨噬细胞、T细胞浸润及同种肾移植排斥反应的程度密切相关。此外,Toubai等研究发现在大鼠同种异体干细胞移植模型中MIF对移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GVHD）的发生、发展也起着关键的作用。鉴于MIF在同种移植排斥反应中的重要作用,本研究第一部分选择MIF作为同种移植排斥分子影像学的新靶点,阐明MIF的表达与移植排斥反应程度的相关性,并在此基础上利用放射性核素131I标记的MIF单克隆抗体作为分子显像剂,动态监测同种移植排斥反应的全过程,旨在为无创伤性监测移植排斥反应探索新的途径。准确评价移植术后免疫抑制治疗的效能,监测受者的免疫状态,根据受者的免疫状态来调整免疫抑制剂的用量是移植监测的另一关键目标。通过移植监测可以指导移植后免疫抑制剂的合理使用,实现药物应用的个体化。由于免疫抑制剂可以抑制T细胞、B细胞等靶细胞的增殖及细胞因子合成,因此应用免疫抑制剂之后如仍以移植排斥早期释放的细胞因子作为分子影像学的成像对象显然不能客观地反应移植物的免疫状态。寻找移植排斥分子显像新靶点,从而准确地评价移植后免疫抑制治疗后的效能,是移植监测领域的又一关注热点。Toll样受体家族（Toll-like Receptor, TLRs）作为一种模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）可特异性识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）,不仅在激活固有免疫中发挥重要作用,而且还在诱导和调节适应性免疫中具有重要意义,是连接固有免疫和适应性免疫的重要桥梁。TLRs信号可以在自身抗原,同种抗原和异种抗原的刺激下激活。2008年研究发现小鼠心脏皮肤同种移植物的长期生存需要天然Tregs的存在,TLR9的特异激活剂CpG可以通过抑制Treg的功能和促进Thl效应性T细胞的分化,抑制同种移植物的存活。TLR7的激活可以促进皮肤同种移植物的排斥；TLR4的激活阻断了利用抗CD154单抗建立的心脏同种移植物的长期存活,由此可见TLRs信号与移植排斥关系密切。TLR5是TLRs家族中唯一具有免疫负调节作用的分子,可直接间接地参与自身免疫病的发病过程。细菌鞭毛蛋白（Flagellin）是TLR5的唯一配体,Flagellin可特异识别结合TLR5,通过激活核转录因子NF-κB刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等前炎症细胞因子的产生,介导机体天然免疫。最新研究表明,TLR5可选择性高表达Treg细胞表面,TLR5的特异激活剂Flagellin可增强CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）对效应性T细胞的抑制作用。2008年有研究报告体内给予TLR5特异激活剂Flagellin,可以保护机体免受化学、细菌病毒和辐射等损害。鉴于Treg细胞在诱导同种移植物耐受过程具有重要作用,TLR5可以调控Treg细胞免疫抑制效应,提示TLR5可能是同种移植排斥过程中又一关键免疫分子。本课题第二部分在研究同种皮肤移植急性排斥过程中TLR5动态表达状况和探讨了免疫抑制剂雷帕霉素对TLR5表达的影响的基础上,纯化提取TLR5特异激活剂Flagellin,利用放射性核素13’I标记Flagellin,并进行了初步鉴定,旨在阐明TLR5在移植排斥过程中的动态表达,初步探讨其作为同种移植排斥标志分子的可行性。研究方法1.MIF在同种移植模型中的表达状况：以BABL/c小鼠为受体,分别以B6小鼠、BABL/c小鼠为供体,建立小鼠同种、同系皮肤移植模型,于移植后第1、7、14、天,分别取移植部位的皮片,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测MIF mRNA的相对表达。同时利用免疫组织化学分析法测定移植后不同时间移植皮片内MIF蛋白表达状况。2.小鼠MIF单克隆抗体（anti-MIFMcAb）的制备及生物学活性鉴定：采用杂交瘤技术制备小鼠MIF单克隆抗体,蛋白质印迹技术（Western blotting）及酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定其特异性,巨噬细胞移动抑制试验（MM I）鉴定其生物学活性。3.131I-anti MIF McAb在小鼠同种皮肤移植模型中的分子显像研究：建立小鼠同种及同系皮肤移植模型,Iodogen法制备131I-anti-MIF McAb、对照抗体131I-IgG。各实验组分别于移植后第1、7、14天尾静脉注射131I-anti-MIF McAb或131I-gc185 kBq/只,24小时后处死,收集血液、移植部位皮片、对侧正常皮片及各组织、器官,观察131I-anti-MIF McAb在小鼠同种皮肤移植模型中的生物学分布状况,计算靶组织与非靶组织的放射性分布比值（T/NT）。同时于移植后各时间点尾静脉注射131I-anti-MIF McAb或131I-IgG3.7MBq,24小时后放射性自显影下观察131I-anti-MIF McAb及其对照抗体在移植皮片部位的放射性浓聚状况。4. TLR5在同种移植模型中的表达状况：建立小鼠同种及同系皮肤移植模型,于移植后第1、7、14、21天,分别取同种移植及同系移植小鼠移植部位的皮片,RT-PCR法检测TLR5 mRNA的相对表达量；免疫组织化学分析法测定移植皮片内TLR5的蛋白表达状况。5.免疫抑制剂雷帕霉素（Rapa）对移植受体TLR5表达及IL-10分泌的影响：建立小鼠同种皮肤移植模型,于移植后第1天腹腔注射Rapa 1.5mg/kg诱导移植耐受,观察Rapa对TLR5 mRNA表达的影响。ELISA检测Rapa对同种移植排斥高峰期活化T细胞IL-10分泌的影响。6. TLR5特异性激活剂Flagellin的制备：体外扩增培养甲型副伤寒杆菌,分离、纯化Flagellin,鉴定Flagellin的纯度及特异性。5. Flagellin体内外处理对同种移植排斥的影响：建立小鼠同种皮肤移植模型,分别给予生理盐水、Flagellin处理后,观察Flagellin对TLR5 mRNA的表达丰度、移植皮片生存状况的影响及两者间的相关性；同时收集同种皮肤移植术后第14天小鼠脾T细胞,经体外分别给予不同浓度的Flagellin处理不同时间后,观察各组TLR5 mRNA的表达状况。6. Iodogen法制备131I-Flagellin,鉴定其标记率、放射化学纯度及体外稳定性。结果1.移植后第1天同种移植与同系移植组移植皮片MIF mRNA的表达量与对侧正常皮片无明显差异。随着移植排斥程度的加剧,同种移植组MIF的mRNA表达量在移植后第7天明显增加,并于移植后第14天达到峰值,而同系移植组MIF的mRNA表达在移植后各时间点无明显变化。免疫组织化学分析显示在移植排斥过程中MIF蛋白的表达呈现与MIF mRNA表达一致的结果：即MIF的高表达仅出现在同种移植排斥模型中,且与移植排斥程度呈正相关。2.成功建立3株稳定高效价分泌抗anti-MIF McAb的杂交瘤细胞株,分别命名为5G2D7,5G2C7,5G2E3。经Western blotting、ELISA及MMI鉴定证明该抗anti-MIF McAb具有良好的抗原特异性和生物学活性。3.生物学分布结果显示：与对侧正常皮片相比,131I-anti-MIF McAb在同种移植皮片部位可呈现较高的放射性,而同系移植皮片部位的放射性与对侧正常皮片无明显差异。131I-anti-MIF McAb在各组织器官的放射性分布结果提示该显像剂主要通过肝脏与肾脏代谢。在同种移植排斥早期131I-anti-MIF McAb的T/NT比值与对照显像剂131I-mIgG相比无明显差异,随着移植排斥程度的加剧,131I-anti-MIF McAb组的T/NT比值逐渐增加,在移植后第14天达到峰值17.13,而对照显像剂的T/NT比值在整个移植排斥过程中呈现逐渐下降的趋势。放射性自显影结果验证了上述结果：即同种移植后第1天131I-anti-MIF McAb与131I-IgG均可在移植皮片部位呈现少量的放射性浓聚,随着移植排斥反应的加剧,131I-IgG在移植皮片部位的非特异性浓聚逐渐消退,而131I-anti-MIF McAb则呈现出较为清晰的影像。4.同种移植组TLR5的mRNA表达量在移植后逐渐增加,并于移植后第14天达到峰值,而同系移植组TLR5的mRNA表达在移植后各时间点无明显变化。5.体内给予Rapa处理后,移植皮片部位TLR5 mRNA的表达量在移植排斥高峰期显著增加。体外实验结果显示,同种移植排斥高峰期T细胞经Rapa （100nmol/L）处理后,培养上清中的IL-10分泌逐渐增加,并于培养后72h达到峰值。6.从甲型副伤寒杆菌中成功分离、纯化出Flagellin, Western Blotting证实所制备Flagellin具有高纯度和高特异性。7.与生理盐水处理组相比,同种皮肤移植模型小鼠经体内给予Flagellin处理后,TLR5 mRNA明显高表达（p<0.05）,且可显著延长移植皮片生存时间（21.57±1.4d）, TLR5mRNA表达量与移植皮片生存时间的变化呈明显正相关趋势；经不同浓度Flagellin体外处理急性排斥期小鼠T细胞不同时间后发现,TLR5 mRNA在Flagellin浓度100ng/ml,培养6h组表达量最高。8.成功制备131I-Flagellin,其标记率为91.6%,比活度为35.27 GBq/μmol;室温放置72小时后仍具有较好的稳定性与免疫学活性。结论1.在同种皮肤移植模型中,MIF的表达量与移植排斥程度密切正相关。2.成功制备了抗小鼠MIF单克隆抗体。3.131I-anti-MIF McAb在同种移植皮片部位可呈现特异性浓聚,作为分子显像剂可较为清晰地显示移植排斥全过程。4.在同种皮肤移植模型中,TLR5的表达量与移植排斥程度密切相关。免疫抑制剂Rapa可上调移植皮片部位TLR5 mRNA的表达,促进同种移植排斥高峰期活化T细胞IL-10的分泌。5.成功制备TLR5特异性激活剂Flagellin。体内外实验证实Flagellin可显著增加移植部位TLR5 mRNA的表达,并延长同种移植皮片的生存时间。6.成功制备了131I-Flagellin,131I-Flagellin具有较好的体外稳定性。1.本研究以MIF作为同种移植排斥监测的新靶点,首次以131I-anti-MIF McAb作为同种移植排斥的分子显像剂,证实了该显像剂在同种移植排斥监测中的高敏感与高特异性。2.首次利用磷屏放射性自显影技术,证实利用131I-anti-MIF McAb作为分子显像剂,可以直观、清晰地动态监测同种移植排斥全部进程。3.首次研究了TLR5与移植排斥进程的相关性及免疫抑制剂Rapa对TLR5表达的上调作用；首次制备了放射性碘131标记的TLR5特异性配体Flagellin;初步探讨了将131I-Flagellin用于评价免疫抑制治疗过程中移植排斥监测的意义。
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