BAFF及其受体融合蛋白的构建表达纯化与功能鉴定

论文摘要

B细胞激活因子（B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF）,又称为B淋巴细胞刺激因子（B lymphocyte stimulator, BLyS）是TNF家族成员之一。它可特异性的刺激B淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体,对B细胞的存活、发育、分化起到重要的调控作用。BAFF可与三种受体:BCMA、TACI和BAFF-R结合,通过激活NF-κB信号转导途径增强B细胞的抗凋亡能力。BAFF的过表达与系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）及干燥综合征（SS）等许多自身免疫性疾病及B细胞肿瘤的发生和发展有着密切关系。由于受体与BAFF具有高亲和力,可特异性识别BAFF并与之结合,因此体外构建表达的BAFF受体胞外段融合蛋白可中和体内过表达的BAFF,控制B细胞的增殖和活化,缓解和治疗与BAFF相关的自身免疫病和B细胞肿瘤。本课题的研究为开发BAFF拮抗剂治疗BAFF相关疾病提供了实验基础。本课题研究方法:对BAFF及其受体融合蛋白原核重组表达载体进行鉴定,表达受体和配体蛋白并对其进行纯化,在体外研究受体与配体相互作用,并在细胞水平鉴定受体中和配体功能的活性。主要研究结果:（一）BAFF及其受体融合蛋白原核重组表达载体的鉴定:本实验室已将钓取的BAFF及其受体基因片段连接到原核表达载体pET-32a或pGEX6p-1上,对重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序鉴定,证明表达载体构建正确。（二）BAFF及其受体融合蛋白的表达与纯化:重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）、JM109等。在IPTG诱导下,使基因在工程菌中表达,经SDS-PAGE鉴定。融合蛋白分别利用镍金属螯合琼脂糖凝胶亲和层析柱和谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液纯化,经浓缩和浓度测定后分装冻干保存。（三）BAFF受体融合蛋白的活性鉴定:首先通过酶联免疫吸附法检测了BAFF与受体融合蛋白在体外结合情况。然后在体外建立的BAFF刺激小鼠脾细胞增殖模型中,观察到融合蛋白对BAFF的活性有一定得拮抗作用,并呈现时间和剂量依赖性。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 BAFF
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 BAFF 的生物学功能
• 1.1.3 作用机制
• 1.2 BAFF 受体
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 BR3
• 1.2.3 BCMA
• 1.2.4 TACI
• 1.3 BAFF 拮抗剂国内外研究进展
• 1.4 本文研究思路和目的
• 第二章 BAFF 及其受体融合蛋白表达载体的鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 重组原核表达载体质粒的活化
• 2.3.2 重组原核表达载体质粒的鉴定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 PCR 产物琼脂糖凝胶鉴定:
• 2.4.2 双酶切产物琼脂糖凝胶鉴定:
• 2.4.3 菌液 DNA 测序结果:
• 2.5 小结
• 第三章 BAFF 及其受体融合蛋白的表达与纯化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 BAFF 及其受体融合蛋白的表达
• 3.3.2 BAFF 及其受体融合蛋白的纯化与浓度测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 BAFF 及其受体融合蛋白的表达与纯化
• 3.4.2 蛋白浓度测定
• 3.5 小结
• 第四章 BAFF 与受体融合蛋白相互作用及功能鉴定
• 4.1 引言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 BAFF 与受体结合的分子模拟
• 4.3.2 BAFF 与受体融合蛋白的体外结合实验
• 4.3.3 体外拮抗 BAFF 引起的小鼠脾细胞增殖
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 BAFF 与受体融合蛋白的体外结合
• 4.4.2 体外拮抗 BAFF 引起的小鼠脾细胞增殖
• 4.5 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 附录
• 缩写一览表
• 致谢