应用SRAP和ISJ技术研究中国苹果树腐烂病菌Valsa mali多样性

论文摘要

苹果树腐烂病（valsa canker of apple）由黑腐皮壳属Valsa spp.引起,是苹果树上的毁灭性病害,在我国分布广、危害重、防治难,每年都会造成严重的产量和经济损失,是目前制约我国苹果产业持续发展的主要因素之一。前期研究结果表明,苹果树腐烂病菌在培养性状、致病性等方面都存在明显分化,性状的多样性与基因多样性联系紧密,然而从分子水平研究腐烂病菌的遗传分化及群体遗传结构,至今尚未报道,严重影响了人们对该病害发生规律的认识,也制约了抗病育种工作和防治理论研究的进展。因此,本研究首次探索应用SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism,相关序列扩增多态性）和ISJ（Intron-Exon Splice Junction,内含子外显子切接点序列）标记技术,对我国苹果树腐烂病菌Valsa mali的遗传多样性进行分析,得到如下结果:1.首先从150对SRAP-PCR引物组合中筛选得到多态性高、稳定性好的引物21对。2.首次建立适用于苹果树腐烂病菌的SRAP标记反应体系:10×Reaction Buffer,2.5μL;MgCl2（25 mM）,2.0μL;dNTPs（10 mM）,0.5μL;Forward primer （10μM）,0.9μL;Reverse primer （10μM）,0.9μL;Taq polymerase （5 U/μL）,0.15μL;DNA（200 ng/μL）,1.0μL;ddH2O,17.5μL。3.首次建立适用于苹果树腐烂病菌的ISJ标记反应体系:10×Reaction Buffer,2.5μL;MgCl2（25 mM）,1.5μL;dNTPs（10 mM）,0.5μL;Primer （10μM）,0.5μL; Taq polymerase （5 U/μL）,0.3μL;DNA（200 ng/μL）,1.0μL;ddH2O ,18.2μL。4.用对所有样品扩增效果均较好的8对SRAP引物,对来自于我国8省16市30个区县的122株苹果树腐烂病菌进行遗传多样性分析。共得到扩增谱带74条,其中多态性条带56条,占总条带的75.68%。5.用6条ISJ引物对来自我国不同地区的24株苹果树腐烂病菌进行遗传多样性分析。共得到条带62条,其中多态性条带41条,占总条带的66.13%,且多态性与地理来源存在相关性。6.对122株来自我国不同地区的苹果树腐烂病菌的SRAP多态性标记进行聚类分析,结果表明,SRAP多态性与病菌的地理来源表现出相关性。同时研究了致病性不同的47株苹果树腐烂病菌的SRAP标记多态性,结果表明,SRAP标记多态性与病菌的致病性存在相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 苹果树腐烂病发生、分布及危害
• 1.1.1 苹果树腐烂病的发生及分布情况
• 1.1.2 苹果树腐烂病的危害症状
• 1.2 苹果树腐烂病病原菌种类研究
• 1.3 苹果树腐烂病菌致病性分化研究
• 1.4 分子标记技术的概念及常用种类
• 1.5 SRAP 分子标记技术
• 1.5.1 SRAP 分子标记原理
• 1.5.2 SRAP 分子标记应用
• 1.6 ISJ 分子标记技术原理及应用
• 1.7 本研究目的与意义
• 第二章 材料方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 供试试剂
• 2.1.4 主要试剂的配置
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌体的培养与收集
• 2.2.2 苹果树腐烂病菌基因组DNA 提取
• 2.2.3 DNA 浓度及质量检测
• 2.2.4 引物的配制与稀释
• 2.2.5 引物的筛选
• 2.2.6 苹果树腐烂病菌PCR 体系的建立
• 2.2.7 苹果树腐烂病菌PCR 扩增
• 2.2.8 PCR 扩增产物的检测
• 2.2.9 数据处理与统计分析
• 第三章 结果分析
• 3.1 基因组DNA 提取
• 3.2 苹果树腐烂病菌PCR 引物筛选
• 3.2.1 SRAP-PCR 引物筛选
• 3.2.2 ISJ-PCR 引物的筛选
• 3.3 苹果树腐烂病菌PCR 体系的建立
• 3.3.1 SRAP-PCR 体系的建立
• 3.3.2 ISJ-PCR 最佳的建立
• 3.4 苹果树腐烂病菌PCR 扩增结果
• 3.4.1 SRAP-PCR 扩增结果
• 3.4.2 ISJ-PCR 扩增结果
• 3.5 苹果树腐烂病菌遗传多样性分析
• 3.5.1 中国苹果树腐烂病菌的SRAP 分析
• 3.5.2 陕西省苹果树腐烂病菌的SRAP 分析
• 3.5.3 陕西省杨凌地区苹果树腐烂病菌的SRAP 分析
• 3.6 苹果树腐烂病菌遗传多样性与地理来源相关性分析
• 3.7 苹果树腐烂病菌遗传多样性与致病性分化相关性分析
• 3.8 苹果树腐烂病菌SRAP 扩增体系的可靠性分析
• 3.8.1 来自不同地区24 株苹果树腐烂病菌的SRAP-PCR 分析
• 3.8.2 来自不同地区24 株苹果树腐烂病菌的ISJ-PCR 分析
• 3.8.3 SRAP 标记体系与ISJ 标记体系的比较
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 建立适用于苹果树腐烂病菌的SRAP-PCR 体系
• 4.2 建立适用于苹果树腐烂病菌的ISJ-PCR 体系
• 4.3 SRAP-PCR 稳定性与可行性分析
• 4.4 ISJ-PCR 稳定性与可行性分析
• 4.5 苹果树腐烂病菌遗传多样性与地理来源存在相关性
• 4.6 苹果树腐烂病菌遗传多样性与致病性有一定相关性
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介