转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究

论文摘要

fat-1基因编码ω-3 PUFAs脱氢酶,可以将PUFAs从ω-6转化为ω-3形式。本研究目的是通过动物转基因技术将fat-1转入绵羊的基因组,再利用动物克隆技术创造能产生ω-3 PUFAs的转基因绵羊,从而培育含ω-3 PUFAs丰富的转基因肉羊新材料。以我区绵羊为对象,摸索了绵羊克隆胚的构建和胚胎移植体系;建立雄性绵羊胎儿的皮肤成纤维细胞系;克隆了秀丽隐杆线虫的fat-1基因,构建目的基因表达载体;再将其转染到绵羊成纤维细胞基因组中,经G418筛选,PCR鉴定后选择阳性细胞建立转基因细胞系;通过体细胞克隆动物技术构建并生产转基因克隆胚并移植,待移植后代出生后鉴定并检测其肌肉中ω-6和ω-3 PUFAs的相对含量及比值;以获得转基因的具有保健功能的肉羊新品种。1.绵羊体细胞克隆体系的优化本实验主要是对体细胞克隆胚移植胚龄的摸索。采用组织块种植法分离培养了三种雌性成年绵羊耳皮肤成纤维细胞系,分三个阶段进行绵羊体细胞克隆体系的优化。第一阶段构建了来源于1号细胞的重构胚272枚,体外发育到桑椹胚期移植入17只受体羊中,有一只妊娠,妊娠率为5.88%,产羔羊1只,经鉴定为克隆羊。第二阶段构建了来源于2号细胞的重构胚683枚,分别在胚胎发育的不同时期进行了胚胎移植,共移植了35只受体羊。结果显示,在3只移入的胚龄是1-细胞期胚胎的羊中,有一只妊娠并产羔1只,经鉴定为克隆羊。第三阶段构建了来源于3号细胞的重构胚197枚,在1-细胞期阶段全部移入了11只受体羊中,结果有两只羊妊娠,妊娠率为18.18%,生产了3只克隆羊,产羔率为27.27%。有效地的重复了第二阶段实验。待克隆羔羊性成熟和体成熟后对其进行了自然交配,成年体细胞克隆羊正常顺产2胎,均是双胞胎。表明获得的克隆羊具有正常的生殖和哺育后代的能力,进一步证明,本实验室建立了相对稳定的的体细胞克隆绵羊技术体系。2.转基因体细胞克隆体系的建立采用组织块种植法分离纯化了约40日龄绵羊胎儿成纤维细胞;克隆了秀丽隐杆线虫fat-1基因,同时对其进行了密码子的优化与合成,构建了pTFK-c和pTFK-o两个真核表达载体。pTFK-o转染绵羊胎儿成纤维细胞,经G418压力筛选后进行转基因细胞的鉴定。结果表明获得的7个细胞克隆中有5个细胞系的基因组中整合有目的基因,对获得的转基因细胞进行染色体数目分析,其核型正常率为69.77% （2n=54）,符合用于转基因克隆的要求。以筛选到的7号转fat-1基因绵羊胎儿成纤维细胞系为核供体,绵羊去核卵母细胞胞质为核受体生产转基因克隆胚。采用抽吸法共回收卵母细胞4881枚,成熟培养18h成熟率为72.87%。实验共进行去核操作绵羊卵母细胞3557枚,用于融合的卵数是3305枚,共融合3040枚,融合率为91.39%。共分三组移植了处于1-细胞期的2909枚胚胎到230只羊体内,1组移植了146只受体羊,妊娠5只,妊娠率为3.42%,产羔5只,产羔率为3.42%;2组移植了60只受体羊,妊娠18只,妊娠率为30%,产羔19只,产羔率为31.67%;3组移植了24只羊,妊娠5只,妊娠率为20.83%,产羔6只,产羔率为25%。后2组实验结果进一步优化了体细胞克隆技术体系。3.转fat-1基因克隆绵羊的出生与鉴定通过实验共产羔30只,其中19只存活。对获得的30只中的29只转基因克隆羔羊进行基因组水平检测,结果显示有27只羔羊基因组中含有目的基因。克隆羊肌肉组织中ω-6和ω-3PUFAs的相对含量检测结果显示,在检测的23只羊中有18只羊都表达了有活性的脂肪酸脱氢酶,其ω-6/ω-3 PUFAs比值都有不同程度的降低,平均值为16.45,其ω-3 PUFAs的平均值为0.194,和对照公羊平均值0.147相比提高了31.97%,有效的改善了绵羊体内ω-6和ω-3 PUFAs的相对比例和含量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 动物转基因技术的研究历史
• 1.1.1 动物转基因技术研究的初级阶段
• 1.1.2 动物转基因技术研究的初级应用阶段
• 1.1.3 动物转基因技术研究的高潮阶段
• 1.1.4 小结
• 1.2 转基因动物制作方法及其发展概况
• 1.2.1 显微注射法
• 1.2.2 逆转录病毒载体介导的转基因
• 1.2.3 精子介导的基因转移
• 1.2.4 生殖干细胞法
• 1.2.5 胚胎干细胞介导的转基因
• 1.2.6 iPS 介导转基因技术
• 1.2.7 基因打靶介导的转基因技术
• 1.2.8 化学诱变介导的基因敲除技术
• 1.2.9 RNA 干涉介导的基因沉默技术
• 1.2.10 锌指核酸酶介导的基因沉默技术
• 1.2.11 转座子介导的基因转移
• 1.2.12 转基因体细胞克隆法
• 1.3 动物转基因技术的应用
• 1.3.1 动物转基因技术在基础研究领域的应用
• 1.3.2 动物转基因技术在生物药剂和生物材料生产中的应用
• 1.3.3 动物转基因技术在农业生产中的应用
• 1.3.4 动物转基因技术在环保方面的应用
• 1.3.5 动物转基因技术在应用方面存在的问题
• 1.4 ω-3 PUFAs 的研究概况
• 1.4.1 ω-3 PUFAs 的研究背景
• 1.4.2 ω-3 PUFAs 的生物学功能
• 1.5 小结
• 2 绵羊体细胞克隆体系的优化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 动物材料
• 2.1.2 实验设备
• 2.1.3 实验用药品、试剂和耗材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 绵羊耳皮肤成纤维细胞的分离培养
• 2.2.2 绵羊耳皮肤成纤维细胞生长曲线的测定
• 2.2.3 绵羊耳皮肤成纤维细胞的染色体数目分析
• 2.2.4 绵羊卵母细胞的采集和体外成熟培养
• 2.2.5 供体细胞的准备
• 2.2.6 受体卵母细胞的准备
• 2.2.7 核移植制备重构胚
• 2.2.8 重构胚的融合
• 2.2.9 重构胚的激活和发育培养
• 2.2.10 胚胎移植
• 2.2.11 妊娠的确定和克隆羔羊的接产
• 2.2.12 克隆羔羊的鉴定
• 2.2.13 克隆羊生殖能力检测
• 2.2.14 数据统计
• 2.3 结果
• 2.3.1 绵羊耳皮肤成纤维细胞的分离培养
• 2.3.2 绵羊耳皮肤成纤维细胞生长曲线的测定
• 2.3.3 绵羊耳皮肤成纤维细胞的染色体数目分析
• 2.3.4 绵羊卵母细胞的采集与体外成熟
• 2.3.5 克隆胚构建中融合条件的摸索
• 2.3.6 绵羊体细胞克隆胚的构建、体外发育和胚胎移植
• 2.3.7 克隆羔羊的接产及其鉴定
• 2.3.8 克隆羊生殖能力检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 卵巢的运输和保存
• 2.4.2 卵母细胞体外成熟与重构胚的制作
• 2.4.3 克隆胚移植胚龄的摸索
• 3 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养
• 3.1 材料
• 3.1.1 活体材料
• 3.1.2 实验设备
• 3.1.3 实验用药品、试剂和耗材
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 绵羊胎儿性别的鉴定
• 3.2.2 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养
• 3.2.3 绵羊胎儿成纤维细胞生长曲线的测定
• 3.2.4 绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 绵羊胎儿的性别鉴定
• 3.3.2 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养
• 3.3.3 绵羊胎儿成纤维细胞生长曲线的测定
• 3.3.4 绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析
• 3.4 讨论
• 4 绵羊胎儿成纤维细胞的基因转染
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验设备
• 4.1.3 实验用药品、试剂和耗材
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 转fat-1 基因表达载体的构建
• 4.2.2 绵羊胎儿成纤维细胞 G418 敏感度的研究
• 4.2.3 绵羊胎儿皮肤成纤维细胞的基因转染
• 4.2.4 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的筛选和纯化
• 4.2.5 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的鉴定
• 4.2.6 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 转fat-1 基因表达载体的构建
• 4.3.2 绵羊胎儿成纤维细胞 G418 敏感度的研究
• 4.3.3 绵羊胎儿成纤维细胞的转染和筛选
• 4.3.4 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的鉴定
• 4.3.5 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析
• 4.4 讨论
• 5 转fat-1 基因克隆胚的构建与移植
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 动物材料
• 5.1.2 实验设备
• 5.1.3 实验用药品、试剂和耗材
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 绵羊卵母细胞的采集和体外培养
• 5.2.2 转fat-1 基因绵羊胎儿成纤维细胞的准备
• 5.2.3 受体卵母细胞的准备
• 5.2.4 转fat-1 基因绵羊克隆胚的制备
• 5.2.5 转fat-1 基因绵羊克隆胚的融合
• 5.2.6 转fat-1 基因绵羊克隆胚的激活和发育培养
• 5.2.7 转fat-1 基因绵羊克隆胚的移植
• 5.2.8 转fat-1 基因克隆羔羊的接产
• 5.3 结果
• 5.3.1 绵羊卵母细胞的采集和体外培养
• 5.3.2 转fat-1 基因绵羊克隆胚的制备及其移植
• 5.3.3 转fat-1 基因克隆羔羊的接产
• 5.4 讨论
• 6 转fat-1 基因克隆羊的鉴定
• 6.1 材料
• 6.1.1 活体材料
• 6.1.2 实验设备
• 6.1.3 实验用药品、试剂和耗材
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 转基因克隆羊羊膜细胞的培养
• 6.2.2 羊膜细胞染色体数目的分析
• 6.2.3 转基因克隆羊的鉴定
• 6.3 结果
• 6.3.1 转基因克隆羊羊膜细胞的培养
• 6.3.2 羊膜细胞染色体数目的分析
• 6.3.3 转基因克隆羊的鉴定
• 6.4 讨论
• 7 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介