芦荟遗传转化体系的建立及人胰岛素样生长因子I转化芦荟的初步研究

论文摘要

本项目将人工半合成的人类胰岛素基因转化芦荟,并研究该基因在植物体内表达;试图获得有人类胰岛素表达、对糖尿病等疾病具有食疗作用的芦荟新品种,为人类疾病的防治提供一条经济有效的新途径;为以芦荟为植物反应器,生产人类胰岛素奠定基础;使芦荟这一热带药用植物资源能够更好地服务于人类。 植物表达载体的构建。选用单子叶植物启动子Ubiquitin和空白载体PUC1301,PVKH-35S-GUS-PA构建了植物表达载体PUC1301-U和PVKH-U。选用植物偏爱密码子改造IGF基因启始密码子,和启动子Ubiquitin构建了植物表达载体PUC1301-U-IGF 芦荟的转化再生体系的建立。通过培养基激素配比的筛选发现,芦荟茎基部接种在MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+蔗糖30g/L分化培养基上,即可诱导出愈伤组织,然后通过愈伤组织出芽和直接产生不定芽,或者直接接种在MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.4mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L出芽培养基上,出芽率较高。直接发生的不定芽只需要2周左右,经愈伤组织再生的不定芽则需要3-4周。在分化培养基上诱导愈伤组织的同时,直接诱导叶片的不定芽分化是比较便捷的再生方式。建立的芦荟植株再生体系具有周期短、效率高等特点。在遗传转化中通过这一体系先诱导出再生芽,再生芽经潮霉素20mg/L选择压筛选后,抗性再生芽的存活率达到3.19%。 农杆菌介导的芦荟遗传转化体系。通过对农杆菌介导芦荟遗传转化影响因素系统的研究,建立优化芦荟转化体系为:用继代培养获得的粗壮的芦荟单株茎基部作为转化外植体;预培养3天;以构建好的浓度为OD6000.3的BLA4404和GV3103农杆菌工程菌液侵染15-30min;农杆菌与外植体共培养3天;在加有300mg/L Carb的MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D2.0mg/L+蔗糖30g/L分化培养基上25℃左右光照培养3-5周;将分化的不定芽转接到选择压为潮霉素20-25mg/L,Carb浓度为250-300mg/L的MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.4mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L选择培养基上,26℃光

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 芦荟组织培养研究进展
• 1.1.1 器官培养
• 1.1.2 愈伤的培养
• 1.1.3 腋芽的组织培养
• 1.1.4 芦荟再生苗的生根
• 1.2 人胰岛素样生长因子Ⅰ（huIGF-Ⅰ）研究进展
• 1.2.1 huIGF-Ⅰ的发现
• 1.2.2 huIGF-Ⅰ蛋白结构
• 1.2.3 huIGF-Ⅰ基因结构
• 1.2.4 IGF-Ⅰ受体（IGFRI）的结构和功能
• 1.2.5 huIGF结合蛋白（IGFBP）
• 1.2.6 huIGF-Ⅰ生物学活性的调节
• 1.2.7 huIGF-Ⅰ的生物学作用
• 1.2.8 huIGF-Ⅰ在病理和临床上的研究与应用
• 1.3 研究目的意义
• 1.4 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 目的基因
• 2.1.3 试剂和药品
• 2.1.4 植物材料
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 IGF-Ⅰ基因的改造
• 2.2.2 PCAMBIA1301-U中间表达载体的构建
• 2.2.3 PCAMBIA1301-U-Ⅰ表达载体的构建
• 2.2.4 PUKH-GUS-U表达载体的构建
• 2.2.5 农杆菌工程菌株的构建
• 2.2.6 植物基因转化
• 2.2.7 转基因植株的鉴定
• 3.结果与分析
• 3.1.PCAMBIA1301／IGF-Ⅰ植物表达载体的构建
• 3.2.农杆菌工程菌株的构建
• 3.3.芦荟再生体系的建立
• 3.3.1 芦荟基部愈伤组织的诱导
• 3.3.2 愈伤组织诱导分化出芽
• 3.3.3 再生植株的生根及移栽
• 3.3.4 芦荟外植体对潮霉素的抗性
• 3.4.叶盘法转化芦荟
• 3.4.1 外植体的预培养
• 3.4.2 农杆菌的侵染与共培养
• 3.4.3 抗性愈伤组织的筛选
• 3.5 转基因植株的分子检测
• 3.5.1 Gus检测
• 3.5.2 PCR检测
• 3.5.3 PCR Southern检测
• 4.结论
• 5.讨论
• 5.1 库拉索芦荟遗传转化体系的建立及转基因芦荟的应用前景
• 5.2 芦荟遗传转化中植株再生的途径和关于诱导愈伤组织过程中褐变的处理
• 5.3 影响芦荟遗传转化得因素
• 参考文献
• 附录
• 致谢