应用栀子苷灌胃建立小鼠肝损伤模型的初步研究

论文摘要

[目的]统计研究中药肝毒性与药性理论（四气、五味、归经等）的相关性。并在此基础上,初步探索应用肝毒性中药栀子的主要成分栀子苷灌胃建立小鼠肝损伤模型,从过氧化损伤和超微结构上分析其机制。[方法]1.中药肝毒性与药性理论的相关性研究：应用文献研究方法,以文献和专著中报道的具有明显肝毒性的中药为研究对象；药性理论内容以国家中医药管理局编写的《中华本草》记载为准,适当参考其他典籍。进行资料整理,统计分析肝毒性中药四气、五味、归经的分布规律,并探索中药肝毒性与药性理论的相关性。2.应用栀子苷灌胃建立小鼠肝损伤模型的研究：（1）昆明种清洁级小鼠50只,体重18-22g,随机分为5组,分别为空白组,栀子苷正常剂量组、15倍剂量组、30倍剂量组、45倍剂量组,每组10只,雌雄各半。栀子苷各组分别以28mg·kg-1,420mg·kg-1,840mg·kg-1,1260mg·kg-1,按0.2mL·10g-1体重栀子苷水溶液灌胃。空白组给予等体积蒸馏水灌胃。每日1次,连续7d,末次给药后禁食18h处死。分别检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）,天门冬氨酸氨基转移酶（aspertate aminotransferase, AST）,计算肝指数,观察肝组织普通病理形态学变化,以探索栀子苷致明显肝损伤的相对合适剂量。（2）昆明种清洁级小鼠50只,体重18-22g,随机分为栀子苷给药组40只、空白组10只,雌雄各半。以探索出的相对合适剂量的栀子苷水溶液灌胃,每日1次,连续给药。给药组于灌胃4d、7d、10d、14d各处死10只,处死前禁食18h。空白组给予等体积蒸馏水灌胃。分别检测血清ALT、AST、总胆红素（total bilirubin,TBil）,计算肝指数,观察肝组织普通病理形态学变化,以确定致明显肝损伤的相对合适时间。探索合适剂量栀子苷灌胃合适时间,小鼠肝组织丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）及电镜下超微结构的改变,空白组做相应处理。[结果]1.中药肝毒性与药性理论的相关性研究：（1）搜集肝毒性中药245味,四气归属之间有显著差异（P<0.05）,由高到低排序为：寒性、温性、平性、凉性、热性,其中归属于寒性的药物明显偏高。搜集一般中药474味,四气归属之间有显著差异（P<0.05）,排序与245味肝毒性中药一致,其中归属于寒性、温性的药物明显偏高（P<0.005）。245味肝毒性中药与474味一般中药在四气归属上有相似的分布规律,统计分析搜集到的药物,中药的肝毒性与四气归属无相关性（P>0.05）。（2）245味肝毒性中药,五味归属之间有显著差异（P<0.05）,由高到低排序为：苦味、辛味、甘味、酸味、涩味、咸味、淡味,其中五味归属于苦味、辛味的药物明显偏高（P<0.002）。474味一般中药,五味归属之间有显著差异（P<0.05）,由高到低排序为苦味、甘味、辛味、咸味、涩味、酸味、淡味,其中五味归属于苦味、甘味、辛味者明显偏多（P<0.002）。统计分析搜集到的245味肝毒性中药与474味一般中药,中药肝毒性与五味归属有相关性,但关联度不高（P<0.05,rp=0.137）。（3）搜集有归经记载的肝毒性中药178味,归经之间有显著差异（P<0.05）,由高到低排序为：肝经、肺经、胃经、脾经、肾经、心经、大肠经、膀胱经、胆经、小肠经、心包经、三焦经,其中归经于肝经的明显偏多（P<0.0008）。474味一般中药,归经之间有显著差异（P<0.05）,排序与178味肝毒性中药一致,归经于肝经的明显偏多（P<0.0008）。178味肝毒性中药与474味一般中药在归经上有相似的分布规律,统计分析搜集到的药物,中药肝毒性与归经无相关性（P>0.05）。2.应用栀子苷灌胃建立小鼠肝损伤模型的研究：（1）不同剂量栀子苷灌胃对小鼠血清ALT、AST,肝指数的影响：与空白组比较,正常剂量的栀子苷对小鼠血清ALT、AST及肝指数无明显影响（P>0.05）。15、30、45倍剂量时,ALT、AST及肝指数显著升高,与空白组比较有统计学意义（P<0.05）,以30和45倍剂量组损伤明显。（2）不同剂量栀子苷灌胃对小鼠肝组织形态学的影响：与空白组比较,正常剂量的栀子苷对小鼠肝组织形态无明显影响（P>0.005）。栀子苷15、30、45倍剂量组与空白组比较有显著的统计学意义（P<0.005）,其中以30、45倍剂量组肝损伤明显。（3）30倍剂量栀子苷灌胃不同时间对小鼠血清ALT、AST、TBil,肝指数的影响：与空白组比较,应用30倍剂量栀子苷灌胃4d、7d、10d、14d组小鼠血清ALT、AST、TBil活性,肝指数显著升高（P<0.05）,但四组之间比较无显著统计学差异（P>0.05）。（4）30倍剂量栀子苷灌胃不同时间对肝组织形态学的影响：与空白组比较,应用30倍剂量栀子苷灌胃4d、7d、10d、14d后,肝组织形态变化有统计学意义（P<0.005）,其中灌胃7d、10d、14d肝损伤明显。（5）30倍剂量栀子苷灌胃7d对小鼠肝组织MDA、GSH-Px的影响：与空白组比较,应用30倍剂量栀子苷灌胃7d小鼠肝组织MDA、GSH-Px无明显改变（P>0.05）。（6）30倍剂量栀子苷灌胃7d对小鼠超微结构的影响：与空白组比较,应用30倍剂量栀子苷灌胃7d,小鼠肝组织超微结构改变明显（P<0.05）。[结论]（1）肝毒性中药在四气归属和归经方面有明显差别,但与一般中药比较,中药肝毒性与四气归属和归经无相关性。（2）肝毒性中药在五味归属方面有明显差别,与一般中药比较,中药肝毒性与五味归属有一定相关性,但为弱相关。（3）应用30倍剂量栀子苷灌胃7d可造成小鼠明显肝损伤。（4）自由基脂质过氧化可能没有参与栀子苷诱导的肝损伤,但仍需在以后的实验中进一步确定。（5）依据对肝细胞超微结构影响的研究结果,栀子苷对小鼠肝细胞的能量代谢、蛋白代谢及核酸代谢均具有明显影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 中药肝毒性与药性理论的相关性研究
• 对象与方法
• 1 研究对象来源
• 2 判定方法
• 2.1 肝毒性的判定
• 2.2 肝毒性与药性相关性的判定
• 3 统计学分析
• 3.1 统计分析软件
• 3.2 统计分析方法
• 结果
• 1 肝毒性中药与一般中药的搜集情况
• 2 中药肝毒性与四气归属的相关性
• 3 中药肝毒性与五味归属的相关性
• 4 中药肝毒性与归经的相关性
• 第二部分 应用栀子苷灌胃建立小鼠肝损伤模型的初步研究
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 动物
• 1.2 药物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 动物分组及给药
• 2.2 样品的采集和处理
• 2.3 血清生化学检测
• 2.4 肝匀浆检测
• 2.5 肝组织病理切片及HE染色方法
• 2.6 肝组织超微结构观察
• 3 统计学分析
• 3.1 统计分析软件
• 3.2 统计分析方法
• 结果
• 1 栀子苷对小鼠一般状况的影响
• 2 不同剂量栀子苷对小鼠血清ALT、AST活性及肝指数的影响
• 3 不同剂量栀子苷对小鼠肝组织形态学的影响
• 3.1 大体形态学（肉眼观察）
• 3.2 组织形态学（光镜观察）
• 4 30倍剂量栀子苷灌胃不同时间对小鼠血清ALT、AST、TBil及肝指数的影响
• 5 30倍剂量栀子苷灌胃不同时间对小鼠肝组织形态学的影响
• 5.1 大体形态学（肉眼观察）
• 5.2 组织形态学（光镜观察）
• 6 30倍剂量栀子苷灌胃7d对小鼠肝组织MDA、GSH-Px的影响
• 7 30倍剂量栀子苷灌胃7 d对小鼠肝组织超微结构的影响
• 7.1 电镜下观察小鼠肝组织超微结构的变化
• 7.2 肝细胞超微结构的立体计量学测定分析
• 讨论
• 1 现代医学对DILI的认识
• 1.1 CYP代谢异常
• 1.2 免疫反应
• 1.3 自由基脂质过氧化
• 1.4 线粒体损伤
• 2 中医学对DILI的认识
• 2.1 对DILI病因病机的认识
• 2.2 对中药肝毒性的认识
• 3 导师对DILI的认识
• 4 中药肝毒性与药性理论关系探讨
• 5 应用栀子苷灌胃建立小鼠肝损伤模型的初步研究
• 5.1 DILI动物模型研究现状
• 5.2 栀子苷的药性分析
• 5.3 应用栀子苷灌胃建立小鼠肝损伤模型的分析
• 5.4 栀子苷灌胃所致小鼠肝损伤机制的初步探讨
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附录1 肝组织普通病理照片
• 附录2 肝组织超微结构照片
• 附录3 文献综述
• 参考文献