牛完全体外生产胚胎及胚胎性别鉴定取样方法研究

论文题目: 牛完全体外生产胚胎及胚胎性别鉴定取样方法研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 张建新

导师: 岳文斌

关键词: 牛卵泡卵母细胞,体外成熟,体外受精,孤雌激活,体外培养,胚胎取样方法

文献来源: 山西农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 利用哺乳动物卵母细胞成功地进行胚胎体外生产可以为胚胎移植和胚胎研究提供稳定的胚胎来源。胚胎体外生产包括卵母细胞体外成熟、体外受精、孤雌激活、胚胎体外培养和性别鉴定等主要环节,本研究针对影响各个环节的关键因素进行研究,旨在不断完善胚胎体外生产技术。 1 卵母细胞体外成熟（IVM） 本试验研究了不同卵泡大小、不同生殖激素、不同类型血清、大卵泡液及不同成熟时间对牛卵母细胞体外成熟的影响。 结果表明,卵泡大小直接影响其中的卵母细胞体外成熟培养的成熟率,来自直径2～5mm,5～8mm和8～11mm卵泡的卵母细胞体外成熟培养的成熟率分别为40.91%,41.82%和39.09%,显著高于来自直径小于2mm卵泡的卵母细胞成熟率16.36%（P<0.01）,但是卵泡直径超过8mm的卵泡其卵母细胞经成熟培养后卵母细胞质量偏低。 哺乳动物卵母细胞成熟与卵丘的扩张是在激素诱导下完成的,LH,FSH和17β-E2是促进卵母细胞成熟的重要激素,为了了解这三种激素的互作效应,进行了三种激素的交叉组合试验,筛选了三种激素的最佳协作浓度,17β-E2,LH和FSH的协作浓度分别为2.55μg/mL,25.08μg/mL和15.03μg/mL。 血清添加物是卵母细胞体外成熟培养中的一种重要物质,成熟培养液中添加胎牛血清（FBS）和发情牛血清（OCS）,卵母细胞的体外成熟率显著高于添加新生牛血清（NCS）的成熟率（48.97%和47.59%比22.76%,P<0.01）;因此FBS和OCS是牛卵母细胞成熟培养中有效的血清添加物。 无激素与血清存在时,大卵泡液能够明显提高卵母细胞成熟率,成熟液中添加10%和5%的大卵泡液（BFF）卵母细胞成熟率分别为29.63%和16.30%,但成熟率很低;培养液中有激素和血清存在时,大卵泡液对卵母细胞成熟的影响不明显。 卵母细胞合理的成熟时间非常重要,卵母细胞体外成熟培养18h～30h,不同成熟时间卵母细胞成熟率差异不显著（52.27%,54.55%,55.30%,P>0.05）,但是如果成熟时间超过24h体外成熟的卵母细胞质量变差。 2 卵母细胞体外受精（IVF） 本试验主要研究了不同受精液组分、卵丘-卵母细胞复合体结构和精卵共孵育时间对牛卵母细胞体外受精的影响。

论文目录:

文献综述部分

摘要

第一章 哺乳动物卵母细胞体外生产胚胎的生物学原理与研究进展

1 哺乳动物卵母细胞体外成熟的生物学原理与研究进展

1.1 卵母细胞的形成及其生长发育

1.2 卵母细胞体外成熟的特征

1.3 影响卵母细胞体外成熟的因素

1.3.1 动物的种类与年龄

1.3.2 卵巢运送时间与保存温度

1.3.3 采集卵母细胞所选卵泡的大小与形态

1.3.4 卵母细胞的级别

1.3.5 卵母细胞体外培养条件

1.3.6 卵母细胞体外培养的培养基组分

1.4 卵母细胞成熟调控机制

1.4.1 MPF的作用机制

1.4.2 CSF的作用机制

1.4.3 OMI的作用机制

1.4.4 cAMP的作用机制

2 卵母细胞体外受精与精子的体外获能

2.1 哺乳动物卵母细胞体外受精的研究历程

2.1.1 哺乳动物卵母细胞体外受精的早期探索

2.1.2 精子获能的发现

2.1.3 顶体反应的发现

2.1.4 胚胎的体外培养

2.2 精子体外获能

2.2.1 精子体外获能机制

2.2.2 影响精子体外获能的因素

2.2.3 精子体外获能方法

2.3 卵母细胞体外受精

2.3.1 卵母细胞预处理

2.3.2 卵母细胞体外受精

2.3.3 精卵结合的同步性

2.3.4 卵母细胞受精时间

2.3.5 提高精子活力的措施

2.3.6 异常受精的几种情况

2.4 精卵识别的分子基础

2.5 卵母细胞受精后原核形成与融合

3 哺乳动物卵母细胞孤雌激活的生物学原理与研究进展

3.1 哺乳动物卵母细胞孤雌激活的研究历程

3.2 卵母细胞孤雌激活的机理

3.3 卵母细胞孤雌激活的方法与途径

3.4 孤雌激活的卵母细胞的核型类型

3.5 孤雌胚的发育情况

4 哺乳动物早期胚胎体外培养的生物学原理与研究进展

4.1 早期胚胎代谢特点

4.2 早期胚胎基因组的激活与启动

4.3 早期胚胎发育阻滞

4.4 早期胚胎发育阻滞的突破

4.5 胚胎体外培养的关键因素

5 小结与展望

参考文献

第二章 PCR法胚胎性别鉴定的研究进展与生物学原理

1 哺乳动物性别决定因子的发现与研究进展

2 哺乳动物性别决定基因SRY的分子结构

3 哺乳动物性别决定的生物学机制

4 早期胚胎性别鉴定的主要方法

5 PCR技术原理

6 PCR扩增SRY进行早期胚胎性别鉴定的主要技术环节

参考文献

实验研究部分

第三章 牛卵泡卵母细胞体外成熟

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器

1.1.2 试剂与耗材

1.2 实验方法

1.2.1 牛卵巢的采集、运输与前处理

1.2.2 牛卵泡卵母细胞的采集

1.2.3 卵母细胞筛选与分级

1.2.4 卵母细胞成熟培养的基础培养体系

1.2.5 卵母细胞的体外成熟鉴定

1.2.6 实验设计与结果统计

2 实验结果

2.1 牛卵巢不同大小卵泡卵母细胞体外成熟培养的影响

2.2 不同激素及其浓度对牛卵母细胞成熟培养的影响

2.2.1 17β-E2、LH、FSH单因子实验

2.2.2 17β-E2、LH、FSH二次回归正交旋转组合试验

2.3 有无血清及不同类型血清对牛卵母细胞体外成熟培养的影响

2.4 大卵泡液对牛卵母细胞成熟培养的影响

2.4.1 添加激素与血清后大卵泡液对牛卵母细胞成熟培养的影响

2.4.2 无激素与血清存在大卵泡液对牛卵母细胞成熟培养的影响

2.5 不同培养时间对牛卵母细胞成熟的影响

3 讨论

3.1 牛卵巢不同卵泡大小对卵母细胞体外成熟培养的影响

3.2 不同激素及其浓度对牛卵母细胞成熟培养的影响

3.3 有无血清及不同类型血清对牛卵母细胞体外成熟培养的影响

3.4 大卵泡液对牛卵母细胞成熟培养的影响

3.5 不同培养时间对牛卵母细胞成熟的影响

4 结论

参考文献

第四章 牛卵泡卵母细胞体外受精

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器

1.1.2 试剂与耗材

1.1.3 操作液

1.2 实验方法

1.2.1 卵母细胞采集、分级与体外成熟培养

1.2.2 精液解冻、洗涤与精子获能

1.2.3 实验设计与结果统计

2 实验结果

2.1 咖啡因和肝素钠对卵母细胞体外受精的影响

2.1.1 肝素钠对卵母细胞体外受精的影响

2.1.2 咖啡因对卵母细胞体外受精的影响

2.1.3 肝素钠与咖啡因组合试验对卵母细胞体外受精的影响

2.2 不同层数卵丘细胞对卵母细胞体外受精效果的影响

2.3 不同精卵共孵育时间对卵母细胞体外受精效果的影响

3 讨论

3.1 咖啡因和肝素钠对卵母细胞体外受精的影响

3.2 不同层数卵丘细胞对卵母细胞体外受精效果的影响

3.3 不同精卵共孵育时间对卵母细胞体外受精效果的影响

4 结论

参考文献

第五章 牛卵泡卵母细胞孤雌激活

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器

1.1.2 试剂与耗材

1.1.3 操作液

1.2 实验方法

1.2.1 卵母细胞成熟与孤雌激活前处理

1.2.2 孤雌胚体外培养

1.2.3 颗粒细胞单层的制作

1.2.4 实验设计与结果统计

2 实验结果

2.1 Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响

2.2 乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响

2.3 在2.0mM6-DMAP配合下Ionomycin与乙醇对卵母细胞激活效果比较

2.4 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响

3 讨论

3.1 Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响

3.2 乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响

3.3 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响

4 结论

参考文献

第六章 牛早期胚胎体外培养

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器

1.1.2 试剂与耗材

1.1.3 操作液

1.2 实验方法

1.2.1 卵母细胞采集、分级与体外成熟培养

1.2.2 卵母细胞体外受精

1.2.3 颗粒细胞单层的制作

1.2.4 实验设计与结果统计

2 实验结果

2.1 培养液体积对卵母细胞IVM、IVF、IVC的影响

2.2 颗粒细胞对牛卵母细胞及早期胚胎体外培养的影响

2.3 表皮生长因子EGF对牛卵母细胞及早期胚胎体外培养的影响

3 讨论

3.1 培养液体积对卵母细胞IVM、IVF、IVC的影响

3.2 颗粒细胞对牛卵母细胞及早期胚胎体外培养的影响

3.3 EGF对牛卵母细胞及早期胚胎体外培养的影响

4 结论

参考文献

第七章 牛早期胚胎性别鉴定不同取样方法研究

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 胚胎

1.1.2 仪器

1.1.3 PCR性别鉴定所用引物

1.1.4 受体牛

1.2 实验方法

1.2.1 胚胎细胞取样方法

1.2.2 胚胎性别鉴定方法

1.2.3 两种采样法PCR性别鉴定准确性比较

1.2.4 两种采样法对不同发育时期胚胎的损伤程度的比较

2 结果与分析

2.1 两种采样法PCR性别鉴定准确性比较

2.1.1 PCR性别鉴定结果

2.1.2 妊娠结果对PCR性别鉴定结果的验证

2.2 两种采样法对不同发育时期胚胎的损伤程度比较结果

3 讨论与结论

参考文献

第八章 牛卵母细胞体外生产胚胎图谱

英文摘要

发布时间: 2005-08-31

参考文献

• [1].提高绵羊体细胞核移植效率的研究[D]. 赛务加甫.西北农林科技大学2007
• [2].猪卵母细胞体外培养质量评价指标的研究[D]. 张延浩.中国农业大学2017
• [3].牛卵丘—卵母细胞复合体凋亡发生和调控与其发育潜能关系研究[D]. 李海军.内蒙古大学2008
• [4].共轭亚油酸对猪卵母细胞体外成熟、胚胎培养和冷冻保存的作用机制[D]. 贾宝瑜.中国农业大学2014
• [5].牛妊娠期黄体形态结构及卵母细胞体外胚胎生产的研究[D]. 陈静波.西北农林科技大学2003
• [6].Roscovitine （ROS）、亚胺环己酮（Cycloheximide，CHX）和培养温度对山羊卵母细胞减数分裂恢复的调控[D]. 韩东.山东农业大学2008
• [7].LH诱导小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中相关调控网络的研究[D]. 刘雪青.西北农林科技大学2015
• [8].钙调神经磷酸酶对小鼠卵泡卵母细胞发育的影响及调控机制的研究[D]. 王丽.华中农业大学2017
• [9].注射圆形精子细胞的山羊卵母细胞激活和胚胎发育的研究[D]. 刘新勇.山东农业大学2011
• [10].成年体细胞克隆山羊研究[D]. 郭继彤.西北农林科技大学2000

相关论文

• [1].牛卵母细胞及体外胚培养技术研究[D]. 桑国俊.甘肃农业大学2008
• [2].血管内皮生长因子对体外生产牛胚胎体外发育的影响[D]. 罗海玲.甘肃农业大学2001
• [3].热休克对牛卵母细胞和IVP胚胎影响的研究[D]. 李守军.东北农业大学2001
• [4].山羊体外受精和显微受精及相关问题的研究[D]. 周佳勃.东北农业大学2003
• [5].牛妊娠期黄体形态结构及卵母细胞体外胚胎生产的研究[D]. 陈静波.西北农林科技大学2003
• [6].山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究[D]. 吕丽华.山西农业大学2004
• [7].牛羊胚胎工程技术产业化研究与应用[D]. 张立.西北农林科技大学2005
• [8].胚胎工程技术在奶牛繁育中应用的研究[D]. 刘俊平.西北农林科技大学2005
• [9].奶牛胚胎移植技术对比研究和生产体系建立[D]. 吴国利.中国农业大学2005
• [10].建立牛胚胎体外生产体系和快速鉴定胚胎性别的方法[D]. 张志平.西北农林科技大学2006

标签：牛卵泡卵母细胞论文;  体外成熟论文;  体外受精论文;  孤雌激活论文;  体外培养论文;  胚胎取样方法论文;