奶牛乳腺上皮细胞系的建立

论文摘要

乳腺上皮细胞是特化的具有分泌性的功能细胞,是乳腺行使泌乳功能的细胞基础,亦是研究泌乳启动、功能维持、退化等生理过程中内外细胞因子调节、信号传导、功能基因的表达以及乳腺肿瘤的形成、癌变必不可缺少的实验材料。现有的研究显示反刍动物与人类、啮齿类动物泌乳调控机制存在很大的差异,并且相对于其它种类动物而言,反刍动物的乳腺调控机理还未充分证明,主要原因是泌乳量较大的奶牛乳腺上皮细胞的培养较为困难。体外培养的奶牛乳腺上皮细胞在乳腺生长发育和泌乳机制的研究及乳腺生物反应器的应用等方面具有重要作用。目前虽然培养的奶牛乳腺上皮细胞已有一些报道,但往往未成功地建立起奶牛乳腺上皮细胞系,不适合作为研究泌乳机制及检测乳腺表达载体的细胞模型。奶牛乳腺上皮细胞系的建立可为转基因动物生产、泌乳量提高等的研究提供良好的动物体外模型,具有泌乳功能的乳腺上皮细胞系亦可为乳腺发育学、乳腺病理学、泌乳生物工程学研究的细胞模型,因此,有必要对奶牛乳腺上皮细胞的体外培养技术和细胞系建立技术,激素与乳腺上皮细胞分泌功能的关系等方面进行深入研究。本研究选取屠宰场屠宰的泌乳后期的健康荷斯坦奶牛乳腺组织作为实验材料,利用组织块接种法成功地获得了奶牛乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定,通过对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状的检测,建立并鉴定了正常培养的奶牛乳腺上皮细胞系。此外,通过HPLc法对奶牛乳腺上皮细胞中乳糖和酪蛋白进行了测定,反映了激素对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响,从而为奶牛乳腺上皮细胞生物反应器模型的建立和泌乳机制的研究奠定了良好的基础。实验结果表明,本研究获得了纯化的奶牛乳腺上皮细胞,建立并鉴定了奶牛乳腺上皮细胞系。通过细胞传代,反复冻存和复苏,实现了细胞系的长期保存,获得了大量的乳腺上皮细胞。奶牛乳腺上皮细胞在添加表皮生长因子培养液中,生长增殖性状良好,细胞传到20代以上仍保持旺盛的增殖活力。胰岛素培养的细胞中酪蛋白变化不大,而催乳素和孕酮的细胞酪蛋白有明显的升高;对三种激素作用下细胞培养液中酪蛋白在不同时间点含量变化进行了研究,结果发现均明显升高,在24小时内,三种激素升高均最明显;激素对细胞乳糖作用的HPLC结果发现,胰岛素对细胞中乳糖的影响不大,而催乳素和孕酮对细胞中的乳糖有明显的升高作用;对三种激素的培养液在不同时间点乳糖含量进行了研究发现,胰岛素的培养液中乳糖浓度始终很高,但没有什么变化,而催乳素和孕酮的培养液在各个时间点却没有什么明显的变化,含量较低。同时对三种激素在不同时间点对细胞活力影响的研究发现,催乳素和孕酮使细胞活力都有增强,但胰岛素对细胞活力的影响不明显,结果提示胰岛素能够维持奶牛乳腺上皮细胞乳糖合成,催乳素和孕酮均有助于酪蛋白合成,表明这三种激素对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞维持泌乳功能是必需的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 动物细胞培养的研究
• 1.1.1 动物细胞培养的研究范围
• 1.1.2 动物细胞培养技术的应用前景
• 1.1.3 动物细胞系的建立与鉴定
• 1.1.4 动物细胞的形态与结构
• 1.1.5 动物细胞系的生长特点与应用
• 1.2 乳腺结构与泌乳机制
• 1.2.1 乳腺的组织结构
• 1.2.2 乳的组成
• 1.2.3 乳腺发育及维持分泌功能的激素依赖研究
• 1.2.4 泌乳的发动和维持
• 1.3 乳腺上皮细胞培养生物学的研究进展
• 1.3.1 乳腺上皮细胞培养方法概况
• 1.3.2 乳腺上皮细胞系的研究进展
• 1.3.3 乳腺上皮细胞系的应用
• 1.3.4 影响乳腺上皮细胞发育的因素
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要器材和试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养
• 2.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的传代培养及纯化
• 2.2.3 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定
• 2.2.4 奶牛乳腺上皮细胞生物学性状的检测
• 2.2.5 激素对奶牛乳腺上皮细胞生物学功能的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养
• 3.2 奶牛乳腺上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化
• 3.3 奶牛传代乳腺上皮细胞的形态学观察
• 3.4 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定
• 3.5 体外培养的奶牛乳腺上皮细胞的生物学性状检测
• 3.5.1 细胞生长曲线的测定
• 3.5.2 细胞群体倍增时间的测定
• 3.5.3 细胞接种存活率的测定
• 3.5.4 细胞活力检测
• 3.6 激素对奶牛乳腺上皮细胞生物学功能的影响
• 3.6.1 酪蛋白含量的 HPLC分析结果
• 3.6.2 乳糖的 HPLC分析结果
• 3.6.3 激素在不同时间点对乳腺上皮细胞活力的影响
• 4 讨论
• 4.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及纯化
• 4.2 奶牛乳腺上皮细胞系的建立及鉴定
• 4.3 奶牛乳腺上皮细胞系的培养体系
• 4.4 激素与奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能
• 4.5 奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型的建立
• 5 结论
• 5.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离与鉴定
• 5.2 奶牛乳腺上皮细胞系的建立与鉴定
• 5.3 激素对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文