论文摘要
目的构建携带色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）基因的重组腺病毒，为进一步基因治疗脉络膜新生血管（choroidal neovasculrization，CNV）奠定基础。方法（1）从BN大鼠视网膜组织中提取总RNA。巢式RT-PCR扩增PEDF基因cDNA，将PEDF克隆入T载体，行DNA序列分析。提取PEDF质粒和腺病毒穿梭质粒pDC316，以EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，构建重组腺病毒穿梭载体pDC316/PEDF，提取重组质粒后以SacⅠ酶进行酶切鉴定并进行DNA序列分析。脂质体法将pDC316／PEDF质粒与腺病毒基因组骨架质粒共转染293细胞，利用Cre／loxp位点同源重组方法构建重组腺病毒AdPEDF，行PCR鉴定后，大量扩增并以氯化铯（Cesium chloride，Cscl）梯度法纯化，并检测重组腺病毒滴度。（2）检测PEDF在真核细胞中的表达。以AdPEDF感染体外培养的HepG2细胞，1h后更换为等量无血清培养液，培养48h后收集上清，同时以未感染AdPEDF的HepG2细胞培养上清作为对照行Western blot检测PEDF的表达。结果（1）基因测序结果表明，所克隆的PEDF基因包含了大鼠PEDF基因阅读框内的全部序列，与NCBI Sequence Viewer中公布的大鼠PEDF mRNA序列（NM-177927）完全一致。成功构建了重组腺病毒穿梭载体pDC316/EDF，测序验证了其可靠性，以其与腺病毒基因组骨架质粒共转染293细胞，应用Cre/loxp位点细胞内同源重组方法构建AdPEDF，经PCR鉴定证实重组腺病毒构建成功。大量扩增后进行CsCl梯度离心纯化，并行病毒滴度测定，滴度达3.08×1010pfu/mL，满足了体内和体外试验要求。（2）Western blot结果显示感染组细胞上清液有PEDF的表达，对照组没有PEDF的表达。证明AdPEDF能够转染真核细胞使其表达PEDF，并分泌到细胞外。结论成功构建出携带PEDF基因的重组腺病毒AdPEDF，为基因治疗CNV奠定了基础。
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标签：色素上皮衍生因子论文; 重组论文; 基因治疗论文; 脉络膜新生血管论文; 腺病毒论文;