氮源限制促进液体静置培养中灵芝酸的发酵生产

论文摘要

灵芝酸是一类三萜化合物，具有抗肿瘤、抗HIV-1等重要药理活性，但其较低的生产率制约着各种应用。本实验室早期报道的液体静置培养方法有效地提高了灵芝酸（GA）的发酵产量，但仍难满足其大规模临床前研究及其他应用的需求。氮源限制在一些子囊菌亚门真菌中提高了次级代谢物的产量，但至今它对蘑菇类高等真菌中三萜类物质合成的影响尚未见报导。本学位论文针对灵芝菌丝体液体静置发酵过程，研究了氮限制对灵芝酸生产的影响，并初步探讨了其作用机制。实验结果表明，在液体静置培养过程中，氮浓度对灵芝酸的合成有很大的影响：随着培养基中氮（如谷氨酰胺）浓度的不断减少，四种单体灵芝酸GA-Mk，GA-T，GA-S及GA-Me的产量明显提高，当谷氨酰胺浓度减少至3mM时，其最高产量分别达到23.5±1.83mg/L,121.6±16.9mg/L,268.1±17.5mg/L及57.3±2.24mg/L，分别是在60mM谷氨酰胺（对照）条件下的2.11，5.08，5.13和4.0倍。动态实验结果表明，在氮限制（3mM谷氨酰胺）条件下，四种灵芝酸单体GA-Mk，GA-T，GA-S，GA-Me在第16天时达到最高，分别为215.9±19.1,1,175.6±182.4,3,109.0±266.8和704.5±63.6μg/100mg干重，为对照条件下的2.81,5.84,8.33和5.12倍。在氮限制的条件下，灵芝酸合成途径中四个重要的结构基因hmgr，fps，sqs和ls的转录水平在整个发酵过程中都高于对照，其mRNA的最高水平分别是对照的36，18，4.5及3.3倍。它们的表达情况与灵芝酸的积累情况相一致，表明氮限制下灵芝酸的高产可能与合成基因的激活相关。根据文献报导，丝状真菌中氮对次级代谢的调节主要是通过转录因子AreA/NIT-2介导的，生物信息学分析显示在上述四个灵芝酸合成基因的启动子上存在几个AreA的结合位点，为进一步探讨氮限制对灵芝酸合成影响的作用机制，我们克隆了灵芝中可能的AreA的基因片段，qRT-PCR分析表明其转录水平在氮限制的条件下也高于对照，以上结果暗示AreA可能参与了氮限制对灵芝酸生物合成的调节。本论文提出了氮源限制来有效提高灵芝酸产量的方法，并对其作用机制做了探索，为三萜类次级代谢产物灵芝酸的高效生产和调控提供了有用的信息。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 高等药用真菌
• 1.2 灵芝及其活性成分
• 1.2.1 灵芝
• 1.2.2 灵芝的活性成分
• 1.2.3 灵芝酸及其药用活性
• 1.3 灵芝酸的发酵生产及其研究进展
• 1.4 灵芝酸的生物合成途径
• 1.5 氮源对细胞生长及代谢的影响
• 1.6 氮调节在真菌中的作用机制
• 1.7 立题的目的与意义
• 1.8 本论文的主要研究内容
• 第二章 氮源限制提高灵芝菌丝体发酵中灵芝酸的含量
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 菌丝体培养
• 2.2.4 分析方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 限制不同的氮源对细胞生长和灵芝酸产量的影响
• 2.3.2 谷氨酰胺浓度对细胞生长和灵芝酸产量的影响
• 2.3.3 不同谷氨酰胺浓度条件下细胞生长、糖消耗及灵芝酸积累的动态过程
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 氮源限制对灵芝酸合成相关基因表达的影响
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 总 RNA 的提取
• 3.2.2 双链 cDNA 的合成
• 3.2.3 灵芝氮调节转录因子 AreA 基因片段的克隆
• 3.2.4 qRT-PCR 检测 hmgr，fps，sqs，ls 和 areA 基因的表达
• 3.2.5 灵芝酸代谢途径中重要的基因启动子上氮调节位点的预测
• 3.3 结果
• 3.3.1 不同氮浓度条件下灵芝酸代谢途径重要基因的表达
• 3.3.2 灵芝酸代谢途径中重要基因的启动子上氮调节位点的预测
• 3.3.3 灵芝中可能的氮调节因子 AreA 基因片段的克隆及其表达情况分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 结论与展望
• 4.1 全文结论
• 4.2 本文的特色与创新点
• 4.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的论文和申请的专利
• 致谢