木瓜蛋白酶具有水解壳聚糖活性的酶组分分离纯化研究

论文摘要

木瓜蛋白酶能非专一性地水解壳聚糖,但其水解壳聚糖的作用方式和水解机理等方面仍不清楚。本论文研究木瓜蛋白酶具有水解壳聚糖活性成分的分离和纯化,对于进一步阐明非专一性酶水解壳聚糖的作用机理具有重要的学术意义,同时对于酶法生产甲壳低聚糖具有重要的应用价值。首先对五种商品木瓜蛋白酶制剂降解壳聚糖的活性进行比较,从中筛选出一种降解壳聚糖活性较高的木瓜蛋白酶Ⅱ,作用于不同脱乙酰度壳聚糖的结果表明,此酶的最佳底物是壳聚糖Ⅰ,脱乙酰度为85.7%。木瓜蛋白酶Ⅱ降解壳聚糖的最适条件是底物浓度0.5%、pH4.0、40℃、酶底物比10%。在最适条件下木瓜蛋白酶Ⅱ降解壳聚糖时,30min内导致粘度下降百分比达到70.77%,1h之后粘度变化平缓。采用Sepharose CL-6B凝胶柱测定木瓜蛋白酶Ⅱ降解壳聚糖6h和加灭活酶反应产物相对分子质量分布,结果显示木瓜蛋白酶Ⅱ降解壳聚糖产物的相对分子质量主要集中在11943到2899;加灭活酶反应产物的相对分子质量主要集中在35490到10162。采用截留相对分子质量为10000的中空纤维膜对木瓜蛋白酶Ⅱ进行超滤浓缩分离,室温下最佳操作压力为0.1MPa,超滤浓缩倍数为8倍时,可以得到最高具有壳聚糖酶活性的组分。超滤后木瓜蛋白酶Ⅱ的蛋白酶和壳聚糖酶比活力分别从435.10U/mg和2.17U/mg提高到531.39U/mg和2.65U/mg,纯化倍数均提高了1.22倍。SDS-PAGE图谱显示,超滤去除了相对分子质量小于10000的杂蛋白,其纯度得以提高。成分分析表明,超滤后的木瓜蛋白酶制剂中还原糖含量由57.46%降至6.27%。采用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化超滤后的木瓜蛋白酶Ⅱ,胶浓度为10%的分离胶、4%的浓缩胶。制备电泳图谱上显示有五条明显的酶条带,酶活性测定显示条带2具有较高的壳聚糖酶活性,对该条带进行富集获得具有壳聚糖酶活性的单一酶组分。采用SDS-PAGE和HPLC对此纯化酶组分进行纯度鉴定,结果显示为单一条带和单一峰,说明木瓜蛋白酶Ⅱ中存在具有水解壳聚糖的酶组分。LC-MS/MS测定该纯化酶组分的氨基酸序列为MRITISGSPG SGTTTLGRSI AEKYSYRYVS AGEVFRGLAK ERNMDLAAFG KIAETDPAID LEIADARQKEI GESSDDIILE GRLAGWMVEN ADLKILLCAS PECRSTRIAA REGLTEKQAF EMTIEREACE AGRYMEYYEI DILDFSPYDL ILNSETFSAN ELFAIVDAAV SSLLKRE,共有177种氨基酸。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 立题背景和意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 木瓜蛋白酶的来源、结构及功能
• 1.2.2 木瓜蛋白酶降解壳聚糖的研究进展
• 1.2.3 木瓜蛋白酶分离纯化的研究进展
• 1.2.4 其他非专一性酶具有壳聚糖酶活性组分分离纯化的研究进展
• 1.2.5 电泳技术在酶分离纯化中的研究进展
• 1.3 课题的研究内容
• 1.3.1 课题研究的目的
• 1.3.2 研究内容
• 第2章 木瓜蛋白酶降解壳聚糖的特性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验设备
• 2.1.3 试验方法
• 2.2 实验内容
• 2.2.1 木瓜蛋白酶的筛选
• 2.2.2 壳聚糖结构对降解作用的影响
• 2.2.3 底物浓度对酶降解反应的影响
• 2.2.4 pH对酶降解反应的影响
• 2.2.5 温度对酶降解反应的影响
• 2.2.6 酶底物比对酶降解反应的影响
• 2.2.7 时间对酶降解反应的影响
• 2.2.8 酶降解反应过程中粘度的测定
• 2.2.9 木瓜蛋白酶水解壳聚糖产物的分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 壳聚糖脱乙酰度的测定
• 2.3.2 木瓜蛋白酶的筛选
• 2.3.3 选择合适的壳聚糖进行酶水解研究
• 2.3.4 木瓜蛋白酶降解壳聚糖的特性研究
• 2.3.5 酶解过程中粘度的变化
• 2.3.6 木瓜蛋白酶降解壳聚糖产物的相对分子质量分布
• 2.4 本章小结
• 第3章 超滤分离去除木瓜蛋白酶小分子组分的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验设备
• 3.1.3 试验方法
• 3.2 实验内容
• 3.2.1 中空纤维膜的超滤分离效果
• 3.3.2 操作时间对超滤的影响
• 3.2.3 操作压力对超滤的影响
• 3.2.4 超滤浓缩倍数对壳聚糖酶活力的影响
• 3.2.5 超滤过程中蛋白酶活力的变化
• 3.2.6 木瓜蛋白酶超滤分离样品的制备
• 3.2.7 超滤前后木瓜蛋白酶样品的分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 中空纤维膜的超滤分离效果
• 3.3.2 操作时间对超滤的影响
• 3.3.3 操作压力对超滤的影响
• 3.3.4 超滤浓缩倍数对壳聚糖酶活力的影响
• 3.3.5 超滤中木瓜蛋白酶的蛋白酶活力变化分析
• 3.3.6 超滤前后的酶活力比较
• 3.3.7 超滤前后的木瓜蛋白酶的SDS-PAGE分析
• 3.3.8 超滤前后木瓜蛋白酶的成分分析
• 3.4 本章小结
• 第4章 具有水解壳聚糖活性的酶组分的纯化及纯度鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验设备
• 4.1.3 试验方法
• 4.2 实验内容
• 4.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳条件的确定
• 4.2.2 聚丙烯酰胺凝胺电泳分离
• 4.2.3 蛋白凝胶带的制取
• 4.2.4 凝胶带中酶组分的电洗脱回收
• 4.2.5 透析去盐
• 4.2.6 目标条带的确定
• 4.2.7 酶组分的纯度鉴定
• 4.2.8 纯化酶组分的氨基酸测序
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 制备电泳分离纯化
• 4.3.2 SDS-PAGE纯度鉴定
• 4.3.3 高效液相鉴定纯化组分的纯度
• 4.3.4 纯化组分的氨基酸测序
• 4.4 本章小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 创新之处
• 5.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果