论文摘要
目的探讨应用小RNA干扰技术减低Akt2的表达对胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响并阐明其影响机制。探讨应用小RNA干扰技术减低Akt2的表达对巨噬细胞趋化运动的影响并阐明其影响机制。方法利用小RNA干扰技术，应用合成的小RNA干扰质粒转染胶质瘤细胞系LN-229和C6，用RT-PCR和Western blotting技术分别检测Akt2的mRNA和蛋白的表达；划痕实验、趋化运动实验检测胶质瘤细胞的运动能力；体外侵袭实验检测胶质瘤细胞的侵袭能力；应用细胞黏附实验检测胶质瘤细胞的黏附能力；F-actin聚合实验检测F-actin的聚合能力；Western blotting技术检测cofilin和integrinβ1的磷酸化验证Akt2影响F-actin聚合和胶质瘤细胞黏附的机制；Western blotting技术检测Girdin的磷酸化验证影响胶质瘤细胞迁移的机制；通过大鼠脑内胶质瘤侵袭模型验证Akt2的减低对胶质瘤细胞体内侵袭能力的影响。利用小RNA干扰技术，应用合成的小RNA干扰质粒转染THP-1，用RT-PCR和Western blotting技术分别检测Akt2的mRNA和蛋白的表达。趋化运动实验检测THP-1细胞的趋化运动能力；肌动蛋白聚合实验检测F-actin的聚合能力；Western blotting技术检测LIMK／cofilin和PKCζ的磷酸化验证Akt2影响F-actin聚合的机制；通过合成的StealthTM小RNA干扰片段转染小鼠腹腔巨噬细胞并得到Akt2减低的巨噬细胞；划痕实验检测Akt2减低后小鼠腹腔巨噬细胞的迁移能力的变化；检测Akt2减低后小鼠腹腔巨噬细胞向CSF-1和MCP-1的趋化运动能力。结果小RNA干扰技术技术转染胶质瘤细胞后，Akt2的mRNA和蛋白水平均下降；Akt2减低的胶质瘤细胞的趋化运动能力比对照组细胞降低（P＜0.01）；Akt2减低的胶质瘤细胞单位时间内向划痕移动的距离比对照组细胞减少（P＜0.01）；黏附实验结果显示：黏附5min、15min后，Akt2减低的胶质瘤细胞比对照组的黏附细胞数量均减少（P＜0.01）；Akt2减低的胶质瘤细胞侵袭并穿透Matrigel的细胞数量比对照组细胞少（P＜0.01）；Akt2减低的胶质瘤细胞内F-actin聚合比对照组细胞减少；Western blotting结果显示：Akt2减低的胶质瘤细胞内cofilin、integrinβ1、Girdin的磷酸化比对照组细胞不同程度降低，Akt2减低的胶质瘤细胞内MMP-9的表达比对照组细胞减少，MMP-2的表达没有检测到变化；大鼠脑内胶质瘤侵袭实验结果显示：接种Akt2减低的胶质瘤细胞的大鼠脑组织切片内的卫星肿瘤结节数量比接种对照细胞的卫星肿瘤结节数量减少（P＜0.05）。小RNA干扰技术转染THP-1细胞后，Akt2的mRNA和蛋白水平均减低；Akt2减低的THP-1细胞的趋化运动能力比对照组细胞降低（P＜0.01）；Akt2减低的THP-1细胞内F-actin聚合比对照细胞减少；Western blotting结果显示：Akt2减低的THP-1细胞内LIMK／cofilin和PKCζ的磷酸化比对照组细胞不同程度降低，；合成的StealthTM小RNA干扰片段转染小鼠腹腔巨噬细胞后Akt2的mRNA和蛋白水平均减低；Akt2减低的巨噬细胞修复划痕的速度比对照细胞慢（P＜0.01）；Akt2减低的巨噬细胞向CSF-1和MCP-1的趋化运动能力比对照细胞弱（P＜0.01）。结论（1） Akt2通过调控肌动蛋白聚合反应和激活Girdin参与了胶质瘤细胞的迁移和EGF诱导的定向趋化运动。（2） Akt2通过磷酸化cofilin调节胶质瘤细胞的肌动蛋白聚合反应。（3） Akt2通过磷酸化integrinβ1促进胶质瘤细胞与纤维粘连蛋白的黏附。（4） Akt2参与了胶质瘤细胞MMP-9的合成，Akt2通过影响胶质瘤细胞的迁移运动能力和调节MMP-9的合成增强了胶质瘤细胞的向细胞外基质侵袭的能力。（5） Akt2通过调控肌动蛋白聚合反应参与了巨噬细胞的趋化运动。（6） Akt2通过磷酸化LIMK／cofilin调节巨噬细胞的肌动蛋白聚合反应。（7） Akt2可以通过磷酸化PKCζ调控巨噬细胞的肌动蛋白聚合反应。（8） Akt2不仅参与了酪氨酸激酶受体介导的巨噬细胞趋化运动而且参与了G蛋白受体介导的巨噬细胞趋化运动，二种受体介导的趋化运动共享这一信号传导分子。
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