银杏叶绿素降解酶的诱导表达研究

论文摘要

银杏是著名的活化石植物,具有很高的药用、食用和科研价值。银杏叶绿素在秋季大规模降解时叶色变黄明显,叶绿素含量也与黄酮含量呈现相关性。因此研究银杏叶绿素降解酶有重要的科研和应用价值。本论文主要分为四部分:外源因子对离体叶片的叶绿素降解和酶活性的影响:用银杏叶为材料,采用叶圆片试验系统,添加植物激素、碳源、氮源、金属离子,定时取样测定叶绿素含量以及叶绿素酶活性,考察外源因子对离体银杏叶片中叶绿素酶的活性影响。结果表明:叶绿素含量与银杏叶绿素酶活性并不总是成反比,不同的因素处理得到的二者的相互关系不同。对于植物生长调节物质（6-BA）,随着叶绿素含量的增加,叶绿素酶活性保持在较高水平;对于碳源、氮源,叶绿素含量的降低伴随着较高的叶绿素酶活性水平;对于金属离子,随着叶绿素的降解,叶绿素酶活性也降低。银杏组织培养体系的建立以及外源因子对组培苗叶绿素降解和酶活性的影响:用银杏胚为外植体,以MS、6,7-V培养基为基本培养基,进行组织培养。待子叶展开后定时取样测叶片中的叶绿素含量以及叶绿素酶的酶活性。确定MS培养基为基本培养基,最佳取样时间为第七天。将正常生长的小苗在转入添加有乙烯、6-BA、葡萄糖、6-BA和葡萄糖的组合的培养基中培养,定时取样,测定叶绿素酶活。活体内的叶绿素酶酶活受很多因素的影响,其活性变化体现了诸多因素的动态制衡关系;1200ppm的乙烯利处理能够显著提高叶绿素酶活性。银杏叶叶绿素酶的提取:50g银杏叶加入200ml冷丙酮,匀浆、抽滤制得丙酮粉。从丙酮粉中提取叶绿素酶,提取条件为:20 mmol/L,含0.24%（v/v）TritonX-100的磷酸缓冲液（pH 7.0）。提取最佳时间为1h。对粗酶液进行酶学性质分析,确定银杏叶绿素酶反应体系为底物:缓冲液:酶液=1:9:1。最适反应条件为:温度37℃、pH7.0、底物浓度1.6mmol/L。银杏叶叶绿素酶的分离纯化:粗酶经过有机溶剂沉淀、DEAE-离子交换柱层析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,纯化后的酶蛋白经SDS-PAGE检测为单一条带,分子量为27 kD。以上研究将有助于对落叶树种叶绿素酶的认识,为进一步研究银杏叶绿素酶的反应机制及应用打下基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 叶绿素酶与叶绿素降解代谢
• 1.1.1 叶绿素结构与功能
• 1.1.2 叶绿素降解代谢途径
• 1.2 叶绿素酶国内外研究进展
• 1.2.1 叶绿素酶的生理功能
• 1.2.2 叶绿素酶在细胞内的分布
• 1.2.3 叶绿素酶的分离纯化
• 1.2.4 叶绿素酶的生化动力学特征
• 1.2.5 叶绿素酶的基因克隆及诱导表达
• 1.3 银杏研究背景
• 1.3.1 银杏价值
• 1.3.2 国内外银杏胚培养的研究历史与现状
• 1.4 本论文主要研究内容
• 第二章 外源因子对离体银杏叶片叶绿素酶的影响
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 植物激素
• 2.3.2 碳源
• 2.3.3 氮源
• 2.3.4 金属离子
• 2.4 本章小结
• 第三章 银杏成熟胚培养体系的建立和糖、6-BA、乙烯利对组培苗叶绿素酶的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 外植体
• 3.2.2 主要试剂与仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 外植体灭菌
• 3.2.5 培养条件
• 3.2.6 糖与6-BA 对叶绿素酶活的影响
• 3.2.7 不同浓度的乙烯利对叶绿素酶活性的影响
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 培养基的确定
• 3.3.2 转接时间的确定
• 3.3.3 无糖条件下6-BA 对叶绿素酶活性的影响
• 3.3.4 糖源存在下6-BA 对叶绿素酶活的影响
• 3.3.5 乙烯利对叶绿素酶活的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 银杏叶绿素酶的粗提和粗酶酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 缓冲液中TritonX-100 含量的确定
• 4.3.2 缓冲液提取时间的确定
• 4.3.3 最适底物浓度的确定
• 4.3.4 最适反应时间的确定
• 4.3.5 反应体系中丙酮含量的确定
• 4.3.6 最适反应温度的确定
• 4.3.7 最适pH 值的确定
• 4.4 本章小结
• 第五章 银杏叶绿素酶的分离纯化
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 试剂
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 有机溶剂沉淀
• 5.3.2 DEAE 离子交换层析
• 5.3.3 银杏叶绿素酶的纯化结果
• 5.3.4 蛋白质分子量的测定
• 5.4 本章小结
• 第六章 结果与展望
• 6.1 主要结果
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：攻读硕士学位期间发表的论文