整合素αυβ6在结肠癌细胞生存和侵袭中的作用及相关分子机制研究

论文摘要

研究背景:整合素属于粘附分子家族,是一类阳离子依赖的跨膜糖蛋白受体,由α、β亚单位以非共价键结合组成。整合素介导细胞与细胞外基质,以及细胞与细胞之间的相互作用,通过细胞外基质信号传导促进细胞的粘附、增殖、转移和分化。整合素ανβ6是由α、β亚单位以非共价键结合组成的跨膜异二聚体,是一类只表达于恶性上皮性肿瘤组织而在正常组织及良性组织无表达的特殊整合素亚型,目前研究发现ανβ6在多种肿瘤的发生发展、侵袭转移过程中发挥重要作用,对其研究已成为热点,并可为恶性肿瘤的诊治提供广阔的应用前景。在胚胎发育过程中以及上皮源性肿瘤及多种肿瘤细胞系,可见整合素ανβ6高表达。在成年组织炎症和损伤修复过程中,ανβ6可促进上皮细胞增殖、迁移至损伤部位,帮助上皮的重建。在腺上皮来源消化道肿瘤中的表达强度以胰腺癌最高,其次为胃癌、结直肠癌、胆管癌、肝癌;鳞状上皮来源肿瘤如肺癌、口腔鳞状上皮癌亦可见其表达。我们课题组对ανβ6与结肠癌之间的关系进行了系统深入的研究:发现不同类型结肠癌细胞表面具有不同数量的ανβ6表达,且与肿瘤恶性程度密切相关;利用ανβ6-cDNA表达质粒转染结肠癌细胞系SW480,在体内外研究中发现,转染后细胞的增殖能力显著提高,动物实验中成瘤率、瘤体质量、体积等较未转染组均有显著增加,并且通过β6胞内结构域不同部位删除后转染技术证实β6独有的C末端11个氨基酸是控制其恶性行为的关键部位;我们对ανβ6与信号通路之间的关系进行深入研究,通过免疫共沉淀、免疫印迹技术发现ανβ6与ERK之间存在直接连接;肿瘤细胞通过ανβ6-MAPK/ERK信号通路调控MMP-9分泌,随着整合素ανβ6的表达增多MAPK活性增加并伴随MMP-9分泌增多,加速破坏降解细胞外基质促进肿瘤细胞的侵袭转移,通过基因转染技术删除β6胞内段ERK结合位点(746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764,下划线表示两者结合位点)可以显著抑制肿瘤细胞的生长;我们的研究亦发现,在结肠癌细胞中ανβ6可促进细胞增殖,随着肿瘤细胞密度增加伴有PKC活性增强,细胞可通过PKC途径调控新生更多的ανβ6,ανβ6可通过PKC途径诱导MMP-9的分泌增多,降解胞外基质加速细胞扩增,如此交叉循环促进肿瘤的生长;我们利用反义寡核苷酸技术沉默ανβ6在结肠癌细胞系HT29和Widr的表达,显著抑制MAPK活性,以及伴有细胞增殖侵袭能力的降低,在动物实验中可达到抑制肿瘤生长的目的。在最近组织学的研究中,Richard C.Bates等发现,在结肠癌细胞上皮间质转化（EMT）模型中可诱导ανβ6表达,组织芯片-免疫组织化学证实488例结肠癌组织中阳性表达率为37%,在淋巴结及肝癌转移标本中均检测到ανβ6的表达,ανβ6与中位生存时间密切相关,可作为结肠癌预后指标。我们利用组织芯片-免疫组织化学技术检测300例胃癌组织标本ανβ6的表达并分析其与临床病理特征及预后的关系,发现其阳性表达率为36.7%,并且与肿瘤病理类型、分化程度、淋巴结转移、TNM分期密切相关,Kaplan-Meier曲线分析ανβ6阳性表达患者生存期限明显缩短,可作为胃癌的独立预后指标。我们最近的研究发现检测358例原发结肠癌组织ανβ6阳性表达率（34.0%）明显低于63例结肠癌肝转移组织的表达率（71.4%）,提示ανβ6阳性表达患者较阴性表达着更具有肝脏转移能力,该研究为结肠癌肝转移提供了新的理论支持,提示ανβ6在结肠癌侵袭转移过程中起了重要作用。综上所述,ανβ6作为一种重要的细胞粘附分子受体,在胃肠道恶性肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用,其具体的作用机制目前已成为研究热点。本研究是在既往国内外研究的基础上,进一步探讨ανβ6在结肠癌细胞生长侵袭中的作用及相关的分子机制,随着研究的不断深入,必将为特异性靶向抗肿瘤药物的研制开发和恶性肿瘤的生物治疗提供广阔的应用前景。第一部分:整合素ανβ6通过MAPK信号通路调控结肠癌细胞侵袭转移和胞外基质降解研究目的:探讨整合素ανβ6在结肠癌细胞侵袭转移中的作用及调控胞外基质（ECM）降解的相关分子机制。研究方法:1.利用pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector质粒构建ανβ6特异性shRNA表达载体和对照组表达载体。ανβ6特异性shRNA表达载体以脂质体法转染人结肠癌细胞系HT29 72小时,用RT-PCR,westernblotting实验分别检测ανβ6 mRNA和蛋白的表达水平;2.细胞侵袭实验检测RNAi介导ανβ6基因沉默对结肠癌细胞HT29体外侵袭能力的影响;3.Western blot实验检测RNAi介导ανβ6基因沉默对结肠癌细胞ERK1/2,phospho-ERK1/2（P-ERK）表达的影响;4.Western blot实验检测RNAi介导ανβ6基因沉默对结肠癌细胞uPA表达的影响;5.明胶酶谱法检测RNAi介导ανβ6基因沉默对结肠癌细胞MMP-2,MMP-9表达的影响;6.[3H]标记的Ⅳ型胶原降解分析实验检测RNAi介导ανβ6基因沉默对结肠癌细胞胞外基质降解能力的影响以及MAPK信号通路与uPA、MMP-2、MMP-9在胞外基质降解中的作用。结果:1.特异性shRNA表达载体可有效抑制HT29细胞中ανβ6的mRNA和蛋白表达;2.RNA干扰介导抑制ανβ6表达显著抑制HT29细胞的体外侵袭能力;3.RNAi介导ανβ6基因沉默显著抑制结肠癌细胞ERK1/2的表达,更重要的是抑制了其活性形式即磷酸化ERK1/2（phospho-ERK1/2,P-ERK）的表达;4.RNAi介导ανβ6基因沉默显著抑制结肠癌细胞uPA,pro-MMP-9和pro-MMP-2的分泌;5.RNAi介导ανβ6基因沉默可显著抑制胞外基质的降解,且ανβ6介导的胞外基质降解是通过MAPK信号通路调控uPA、MMP-2、MMP-9分泌实现的。结论:整合素ανβ6特异性shRNA表达载体,可有效抑制结肠癌细胞ανβ6的表达;沉默ανβ6表达可显著抑制uPA、MMP-9、MMP-2以及ERK1/2介导的胞外基质降解;ανβ6通过MAPK信号通路调控uPA、MMP-9和MMP-2的分泌及活性,从而调控细胞外基质的降解,在结肠癌侵袭转移中发挥了重要作用（见示意图）。意义:本实验研究结果进一步揭示出ανβ6在结肠癌细胞侵袭转移中的作用及相关分子机制;进一步从细胞及分子水平上解释了前期组织学研究成果如ανβ6可作为胃、结肠癌的独立预后指标,结肠癌ανβ6阳性表达患者较阴性表达着具有更强肝脏转移能力;成功设计出ανβ6 RNA干扰序列及表达载体,为以ανβ6为靶点的结肠癌基因治疗提供理论依据。第二部分:结肠癌细胞抵御凋亡的新机制:整合素ανβ6通过PI-3K/Akt/mTOR信号通路在翻译水平上调控VEGF表达研究目的:探讨整合素ανβ6在结肠癌细胞生长、抵御凋亡中的作用及调控血管内皮生长因子（VEGF）表达的相关分子机制。研究方法:1.通过siRNA介导的RNA干扰技术沉默ανβ6在结肠癌细胞HT29中的表达;RT-PCR、Western blot分别检测ανβ6的mRNA和蛋白水平。RT-PCR、Western blot分别检测沉默ανβ6对VEGF mRNA和蛋白表达的影响;2.通过siRNA介导的RNA干扰技术沉默真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）在结肠癌细胞HT29中的表达;Western blot法检测eIF4E-siRNA转染结肠癌HT29细胞24h对eIF4E蛋白表达的抑制效果,和对VEGF蛋白表达的影响;3.Western blot法检测HT29细胞中siRNA介导的ανβ6沉默对磷酸化4E-BP1（P-4E-BP1）,磷酸化AKT（P-AKT）,AKT表达的影响;4.Western blot法检测PI-3K特异性抑制剂LY294002和mTOR特异性抑制剂rapamycin对HT29细胞VEGF、磷酸化4E-BP1（P-4E-BP1）,磷酸化AKT（P-AKT）,AKT表达的影响;5.利用已构建好的成功转染ανβ6的SW480细胞,使其外源性表达ανβ6,Western blot分别检测未转染组（SW480）、mock转染组（SW480-mock）和转染组（SW480-β6）三组细胞中VEGF、磷酸化4E-BP1（P-4E-BP1）表达的影响;6.HT29细胞经无血清培养基孵育24h诱导凋亡,AnnexinV-FITC/PI双标记染色检测HT29细胞中siRNA介导的ανβ6沉默对细胞凋亡的影响;应用VEGF单克隆中和抗体、PI-3K特异性抑制剂LY294002和mTOR特异性抑制剂rapamycin对HT29细胞凋亡的影响;7.利用已构建好的成功转染ανβ6的SW480细胞,利用AnnexinV-FITC/PI双标记染色、流式细胞分别检测未转染组（SW480）、mock转染组（SW480-mock）和转染组（SW480-β6）以及应用VEGF中和抗体阻滞SW480-β6细胞对细胞凋亡的影响。结果:1.特异性β6-siRNA可有效抑制HT29细胞中ανβ6的mRNA和蛋白表达;沉默ανβ6表达的同时显著抑制VEGF蛋白表达,而VEGF的mRNA水平无变化。提示整合素ανβ6可以在翻译水平上调控VEGF的表达。2.特异性eIF4E-siRNA介导的RNA干扰技术可成功沉默HT29细胞中真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）,同时显著抑制VEGF的表达。提示ανβ6可通过eIF4E介导的帽依赖翻译起始过程调控VEGF表达。3.RNAi介导ανβ6基因沉默显著抑制结肠癌细胞HT29中磷酸化4E-BP1（P-4E-BP1）,磷酸化AKT（P-AKT）的表达。提示整合素ανβ6可以通过调控4E-BP1、AKT的磷酸化而调控VEGF的表达。4.应用信号通路中特异性抑制剂LY294002（PI-3K-specificinhibitor）和rapamycin（mTOR-specific inhibitor）阻滞后,可显著降低HT29细胞VEGF、磷酸化4E-BP1（P-4E-BP1）、磷酸化AKT（P-AKT）的表达。提示ανβ6可通过PI-3K/Akt/mTOR/4E-BP1信号通路调控eIF4E的活性及VEGF的表达。5.成功转染ανβ6的SW480细胞（SW480-β6）较SW480和SW480-mock细胞中P-4E-BP1、VEGF表达明显增多。该结果从反面证实ανβ6可通过影响4E-BP1的磷酸化水平进而调控eIF4E的活性和VEGF的表达。6.HT29各组细胞经无血清培养基孵育24h诱导凋亡,ανβ6沉默HT29细胞组（HT29-β6si）及利用VEGF中和抗体阻滞HT29细胞组凋亡数量显著增多;通过应用信号通路中特异性抑制剂LY294002、rapamycin阻滞HT29细胞后细胞凋亡数量显著增多。提示表达ανβ6的结肠癌细胞具备抵御凋亡的能力,且整合素ανβ6通过PI-3K/Akt/mTOR/4E-BP1信号通路调控VEGF来增强细胞抵御凋亡的能力。7.利用不表达ανβ6的结肠癌SW480细胞,未转染组（SW480）、mock转染组（SW480-mock）较较染细胞组（SW480-β6）和应用VEGF中和抗体阻滞SW480-β6细胞组凋亡细胞数量显著增多。该结果从反面证实ανβ6通过调控VEGF表达来抵御细胞凋亡。结论:本实验从正反两方面证实整合素ανβ6在结肠癌细胞生长和抵御凋亡过程中发挥了重要作用;整合素ανβ6可以通过PI-3K/AKT/mTOR信号通路调控4E-BP1的磷酸化、eIF4E的活性,通过eIF4E介导的帽依赖翻译起始过程调控VEGF的表达;整合素ανβ6在结肠癌细胞凋亡中的作用依赖于VEGF的表达。揭示了结肠癌细胞通过整合素ανβ6建立起一套通过自分泌方式调控VEGF表达并抵御细胞凋亡的机制（见示意图）。意义:本实验是在原来研究基础的进一步深化,创新性地证实ανβ6作为细胞表面黏附因子受体参与PI-3K/Akt/mTOR/4E-BP1信号通路,肿瘤细胞通过该通路以自分泌方式调控VEGF表达;揭示了整合素ανβ6调控结肠癌细胞生长和抵御凋亡的相关分子机制;揭示了肿瘤组织中生长因子过表达的机制;在进一步抗肿瘤治疗研究中可利用整合素ανβ6介导的翻译调控过程为靶点,从而为结肠癌的分子靶向治疗提供了理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分:整合素α ν β 6通过MAPK信号通路调控结肠癌细胞侵袭转移和胞外基质降解
• 前言
• 材料与方法
• 试验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分:结肠癌细胞抵制凋亡的新机制:整合素α ν β 6通过PI-3K/Akt/mTOR信号通路在翻译水平上调控VEGF表达
• 前言
• 材料与方法
• 试验结果
• 讨论
• 参考文献
• 本课题的创新性与局限性
• 致谢
• 攻读学位期间已发表或待发表的论文
• 在读期间参与的课题
• 在读期间获得的奖励
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 外文论文1
• 外文论文2