牛支原体LAMP检测方法的建立及体外传代致弱菌株的特性鉴定

论文摘要

牛支原体（Mycoplasma bovis, M.bovis）是引起奶牛及肉牛多种疾病的重要病原菌。由于牛支原体引起的疾病没有典型症状,且常与其他致病菌混合感染,病情复杂,所以极易被忽视。随着科技的进步以及对该病的不断探索,人们越来越意识到牛支原体的危害性。自1961年首次分离到牛支原体以来,世界上大多数国家都已经发生过牛支原体相关疾病的暴发。到目前为止,没有很好的药物来治疗牛支原体引起的肺炎、乳房炎、关节炎等相关疾病。疫苗的应用也只停留在传统的灭活疫苗,且效果并不理想。2008年我国首次报道了牛支原体肺炎的暴发,经济损失惨重。由于我国养牛模式使牛在不同区域间频繁调动,加速牛支原体的传播,造成了牛支原体病在各个地区不断的暴发,给养牛业造成巨大经济损失本课题根据牛支原体特异性基因uvrC建立了一种环介导等温核酸扩增检测方法,为牛支原体病的快速诊断提供方法。同时通过体外连续传代的方法对牛支原体野毒株进行致弱,并进行毒力评价,从而为研究牛支原体毒力因子及弱毒疫苗奠定基础。具体的研究内容如下：1.牛支原体环介导等温扩增方法的建立环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification, LAMP）是在恒温条件下对目的基因扩增,该方法特异性好、灵敏度高,时间短、操作简单。根据牛支原体特异性基因uvrC设计出LAMP所需的四条引物,建立了牛支原体LAMP检测方法。该方法有很好的特异性,与其他支原体及呼吸道常见菌无交叉反应。该方法检测牛支原体的灵敏度可以达到34 CFU,比普通PCR高10倍。在对98份临床样本的检测中,LAMP有较高的检出率,其中对发病牛临床样本的阳性检出率为92%,而PCR的阳性率为49%；在39份健康牛样本中,LAMP和PCR的的检测结果均为阴性。本研究建立的牛支原体LAMP检测方法较传统的PCR灵敏性更更高检测时间短,且适合于临床样本的检测。2.牛支原体体外传代致弱菌株的特性鉴定将牛支原体临床分离株MbovHB0801做为原代菌株进行传代培养。MbovHB0801株已经通过前期实验充分证明其为牛支原体,且有较强的致病性。比较F115代与F1代菌株生长曲线无显著差异,通过SDS-PAGE及Western blot比较有多处蛋白条带产生差异性。用F1、F115、F150.1和F150.2四个不同代次的菌株按10’0CFU、1011CFU、3×1011CFU三个不同的感染量来感染牛,通过观察临床症状,测定体温、血常规、血清抗体、血清IFN-β和IFN-7以及鼻拭子排菌等指标评价菌株的毒力和免疫原性。结果发现,150代的菌株毒力已经降低,临床症状轻微,其中F150.2代效果最显著。F150.2代菌株感染牛体重较F1代菌株感染牛体重有显著增加（P<0.01）,肺部病变打分较低,与对照组差异不显著（P>0.05）,而与F1代感染组有较显著差异（P<0.05）,血常规指标表明接种牛不发生严重的炎症反应,且可以很好的诱导抗体反应,感染后6天IFN-β值可以达到414pg/mL,与Fl代感染组相当。综合比较,该代次菌株毒力较弱且保持良好的的免疫原性,提示该弱毒菌株可作牛支原体弱毒疫苗的侯选菌株,为牛支原体新型疫苗的研发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第1章 文献综述
• 1.1 病原学研究进展
• 1.2 临床症状及病理变化
• 1.3 致病机制研究
• 1.4 诊断方法研究
• 1.5 防治方法研究
• 1.6 免疫应答及疫苗研究
• 1.7 流行现状及对经济的影响
• 1.8 目的及意义
• 第2章 牛支原体LAMP检测方法的建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液及培养基配制
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的准备
• 2.2.2 DNA提取
• 2.2.3 目的基因的选择
• 2.2.4 引物设计
• 2.2.5 LAMP反应及条件优化
• 2.2.6 LAMP扩增产物的鉴定
• 2.2.7 PCR方法
• 2.2.8 LAMP灵敏度检测
• 2.2.9 LAMP特异性检测
• 2.2.10 临床样本的检测
• 2.3 结果及分析
• 2.3.1 LAMP扩增产物分析
• 2.3.2 LAMP反应最佳条件
• 2.3.3 LAMP灵敏度检测
• 2.3.4 LAMP特异性检测
• 2.3.5 临床样本检测
• 2.4 讨论
• 第3章 牛支原体体外传代致弱菌株的特性鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株来源
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要溶液及培养基配制
• 3.1.4 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌株的选择
• 3.2.2 牛支原体培养条件的研究
• 3.2.3 牛支原体体外传代培养
• 3.2.4 不同代次牛支原体生长曲线
• 3.2.5 不同代次牛支原体SDS-PAGE及Western blot比较
• 3.2.6 不同代次MbovHB0801株毒力差异评价
• 3.2.6.1 感染方案
• 3.2.6.2 临床指标记录
• 3.2.6.3 动物剖检、样品采集及处理
• 3.2.6.4 组织病理学检测
• 3.2.6.5 血清ELISA抗体检测
• 3.2.6.6 白细胞总数及中性粒细胞百分比检测
• 3.2.6.7 干扰素检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 牛支原体培养条件选择
• 3.3.2 不同代次生长曲线比较
• 3.3.3 SDS-PAGE及Western blot比较
• 3.3.4 不同代次MbovHB0801株毒力差异评价
• 3.3.4.1 临床症状
• 3.3.4.2 体重变化
• 3.3.4.3 体温变化
• 3.3.4.4 血常规检测
• 3.3.4.5 病原分离
• 3.3.4.6 组织病变
• 3.3.4.7 病理组织学检测
• 3.3.4.8 ELISA抗体水平
• 3.3.4.9 干扰素检测
• 3.4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录