大鼠DJ-1基因的克隆和表达

论文摘要

目的与方法:帕金森（Parkinson,PD）是仅次于阿尔茨海默病的第二大常见神经变性疾病。PD疾病的发生一般以散发型为特征,被认为是基因易感性和例如暴露于毒性的外在因素的共同作用。其基因易感性也是单基因遗传性基因缺陷的结果,目前已经证实与十五种基因有关:PART1～PART11以及DAT基因、TAU基因、Pitx3基因、CTSD基因。这些基因的发现提供了一个研究PD疾病的新视角,但仍未获得对这种疾病的有效治疗措施。DJ-1是被发现与家族性PD有关的第三个基因,蛋白质印迹分析显示DJ-1蛋白广泛存在于肝脏、骨骼肌、肾脏、大脑和睾丸。其在细胞内分布在细胞核、线粒体与胞浆,但主要在细胞浆中。在大脑组织,DJ-1蛋白在边缘系统有大量表达,这些区域包括尾状核、丘脑和黑质、海马区,这些区域与PD的关系最为密切。突变导致的DJ-1功能缺失可以诱发早发型PD,DJ-1的突变率比较低,大约1%。DJ-1蛋白在结构上属于Thij/PfPI家族,含有一个保守序列,这个家族的Thij结构与GAT结构域相关,但却有着不同的功能。DJ-1蛋白有189个氨基酸,一般以二聚体形式存在。在DJ-1晶体中,两个DJ-1单体有着广泛连接,二者接触面积覆盖了整个分子表面的35%面积,其疏水基团与功能有着密切的联系。人与猴、大鼠、小鼠、鸡的DJ-1同源性大约分别为98%、91%、91%、89%,本试验采用大鼠DJ-1作为研究。本实验分两部分进行。第一部分为线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。通过建立正确的模型,成功进行DJ-1基因的诱导表达。第二部分为大鼠DJ-1的克隆与表达。在建立模型诱导表达后,利用TRIZOL法进行RNA的提取,以DJ-1的信使RNA为模板,进行RT-PCR扩增出DJ-1编码基因。将该基因克隆入pGEM-T Easy载体,并进行DNA序列分析。在此基础上,将编码DJ-1的基因片断克隆至表达载体pQE30上,获得重组表达载体pQE30/DJ-1（简称为pQE30/DJ-1）,经测序证实重组入表达载体pQE30/DJ-1的DJ-1成熟肽编码基因的序列与GenBank中所检索到的序列完全一致后,将表达载体pQE30/DJ-1转化入感受态细胞E.coli JM109,进行融合表达。表达条件进行优化后,DJ-1的表达量达到50mg/L培养基。目的蛋白含有6×His纯化标签,可以经金属鳌合亲和层析吸附于Ni-NTA树脂层析柱,梯度增加冲洗液中咪唑浓度以去除非特异吸附的杂蛋白后,将目的蛋白洗脱,超滤离心法浓缩。经SDS-PAGE、Western blotting证实蛋白质产物确实为融合蛋白DJ-1,且融合蛋白具有免疫原活性。结果与结论:由于在国内暂时还没有DJ-1的相关研究,我们进行了DJ-1的初步探索,成功建立了原核表达系统,为进一步研究其蛋白质功能奠定了基础。并且融合蛋白的获得为以后基因工程生产有生物活性的DJ-1奠定了基础,使进一步有效治疗帕金森症成为可能。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 大鼠DJ-1基因的克隆和表达
• 1.对象和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述
• DJ-1的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢