论文摘要
目的:观察振荡磁场和/或静磁场下填充超顺磁性壳聚糖质粒（pAdTRACKBMP9）明胶微球（SPCPGM）的生物活性人工骨促进骨缺损愈合的作用,探讨其成骨效果及其临床应用价值。方法:⑴化学共沉淀法制备超顺磁性壳聚糖纳米微球（SPFCN）,用透射、扫描电镜和振动样品磁强计等仪器对合成的SPFCN进行形态观察和结构表征。⑵制备大量能够在真核细胞中表达人骨形态发生蛋白BMP9（hBMP9）的质粒（pAdTRACKBMP9）。用PvuⅡ、SalⅠ双酶切后行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定,对质粒进行DNA序列测定,用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪测定其纯度和浓度。⑶制备超顺磁性壳聚糖质粒（pAdTRACKBMP9）复合物（SPCPN）。用琼脂糖凝胶电泳观测超顺磁性壳聚糖纳米球（SPFCN）与质粒（pAdTRACKBMP9）的结合能力。⑷用交联固化法制备超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球（SPCPGM）和不含质粒的超顺磁性壳聚糖明胶微球（SPCGM）。用纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨水泥（由四川大学纳米生物材料研究中心提供）制备中空带侧孔的仿兔桡骨中段骨缺损修复支架,将一定量的两种微球分别填入中空支架中。⑸选用新西兰大白兔60只,建立兔桡骨双侧骨缺损模型,随机分为（A组）SPCPGM+振荡磁场+静磁场;（B组）SPCPGM+静磁场;（C组） SPCGM+振荡磁场+静磁场;（D组）SPCGM;（E组）空支架。术后1周、2周、4周、6周、8周、12周,搜集标本,通过大体观察,X线影像学检测,组织切片光学显微镜观察,求积仪测量和计算机图像分析系统分析等方法对缺损处成骨情况进行定性及定量测定,将所获得的数据进行统计学分析,以评估五种不同处理组成骨的情况。结果:⑴扫描电镜下Fe3O4纳米粒外形呈圆形或椭圆形,均匀度好,粒径为23±2.47nm;氮含量为0.0053mg/L。振动样品磁强计检测结果示制备的超顺磁纳米微球具有超顺磁性。⑵质粒（pAdTRACKBMP9）经扩增、纯化后,PvuⅡ、SalⅠ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析鉴定显示:BMP9片段大小与预期（1290 bp）相符,基因序列测定结果表明,基因序列正确。用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪检测质粒浓度为1.13±0.07mg/ml。⑶用琼脂糖凝胶电泳分析SPFCN与质粒（pAdTRACKBMP9）结合时的最适氮/磷（N/P）比例为2.5/1。⑷磁场（振动磁场和/或静磁场）下SPCPGM促进人工骨成骨的体内实验研究表明:①SPCPGM具有明显的促进体内局部成骨的作用。②静磁场能够促进SPCPGM体内局部成骨作用,效果优于使用SPCGM。③静磁场和振动磁场联合应用,能够明显提高SPCPGM体内局部成骨作用,4周时已有大量成骨。④促进成骨的作用的顺序: 1)SPCPGM+振荡磁场+静磁场;2)SPCPGM+静磁场;3)SPCGM+振荡磁场+静磁场;4)SPCGM;5)空支架。⑤振动磁场的应用,能够促使局部磁性微球残留量的明显减少,这对避免局部药物残留可能造成的近期或远期的不良后果具有重要意义。结论:在振动磁场和静磁场联合应用下,能够明显提高SPCPGM体内局部成骨作用,4周时已可达到大量成骨;振动磁场的应用,能够促使局部磁性微球残留量的明显减少,这对避免局部药物残留可能造成的近期或远期的不良后果具有重要意义。