重组谷氨酰胺转胺酶的原核表达研究

论文摘要

谷氨酰胺转胺酶,又称转谷氨酰胺酶（Transglutaminase,简称TGase或TG,全称:protein-transglutayltransferase, EC.2.3.2.13）,其系统名称为蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺基转移酶。TG作为一种新型酶制剂,在食品工业、医药工业中有着重要作用,其应用前景广阔,受到了国内外学者的广泛关注。20世纪90年代以来,日本将微生物来源的谷氨酰胺转胺酶（MTG）商品化并获得巨大经济效益,国内,TG的研究和开发尚处于起步阶段。本实验室从土壤中筛选出一株高产谷氨酰胺转胺酶的菌株,鉴定为灰色轮丝链霉菌（Streptomyces griseoverticillatus）,命名为Streptomyces H197,其发酵液中MTG酶活最大可达到1.74U/mL。为了促进我国谷氨酰胺转胺酶的产业化生产及应用开发,运用基因工程手段,以Streptomyces sp H197染色体DNA为模板,设计引物扩增TG产酶基因,并对产酶基因进行分析,构建表达质粒并转化至表达载体。实验表明,pET30α与E.coliBL21（DE3）宿主菌所构成的表达系统经IPTG诱导,主要生产包涵体形式的重组谷氨酰胺转胺酶蛋白。根据实验确定其最优表达条件为摇菌转速250 r/min,IPTG终浓度1.0 m moL/L,37℃时诱导培养4 h。诱导条件优化后,目的蛋白表达量增加10%。粗提包涵体蛋白后,加入Triton X-100、溶菌酶等洗涤粗酶,有助于除去部分杂蛋白。重组MTG以融合蛋白形式表达,由于其含有His-tag,故利用亲和层析法进行纯化,提高目的蛋白纯度同时去除融合蛋白中的非目的片段。通过透析法及上柱法,使包涵体蛋白恢复生物学活性,分别测得酶活为0. 42U/ml、0.71U/ml,比活为0.182U/mg、0.236U/mg。结果显示,上柱法比透析法复性效率高。为了达到工业化生产的目的,本文对其可溶性表达策略进行了初步探索。其一,选用其他诱导剂替代IPTG。乳糖作为IPTG的类似物,其价格廉价、无毒无害,进行诱导表达目的蛋白。结果表明,在乳糖的诱导下,重组谷氨酰胺转胺酶蛋白主要为可溶性表达,但表达量明显减少。其二,采用低温诱导策略。分别于不同温度（15℃、20℃、25℃、30℃、37℃）下对重组菌株进行IPTG诱导。结果显示,30℃下,目的蛋白以可溶性形式表达的量（2.0801mg/ml）最大,但与包涵体形式表达的产量相比,还是明显减少。以上结论可作为工业化生产重组谷氨酰胺转胺酶的实验室基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 谷氨酰胺转胺酶的概述
• 1.1.1 谷氨酰胺转胺酶的结构、作用及性质
• 1.1.2 谷氨酰胺转胺酶的分类及应用
• 1.1.3 谷氨酰胺转胺酶的研究进展
• 1.2 MTG 的原核表达
• 1.2.1 微生物来源谷氨酰胺转胺酶酶原基因的克隆
• 1.2.2 表达载体的的选择
• 1.2.3 国内外MTG 原核表达的研究进展
• 1.3 目的蛋白的包涵体形式表达研究
• 1.3.1 包涵体的概述
• 1.3.2 包涵体的形成机制
• 1.3.3 包涵体蛋白的特点
• 1.3.4 包涵体蛋白的研究方法
• 1.3.5 包涵体表达形式的优越性
• 1.4 重组酶的研究策略
• 1.5 本文构想
• 第二章 重组谷氨酰胺转胺酶基因表达载体构建
• 2.1 前言
• 2.1.1 MTG 的发酵生产
• 2.1.2 选择合适的表达载体
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.2 实验步骤
• 2.2.3 结果与分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 原核表达条件优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要试剂及仪器
• 3.2.3 实验步骤
• 3.3 结果与分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组包涵体蛋白的纯化与体外复性
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 主要溶液
• 4.2.5 实验步骤
• 4.2.5.1 诱导重组菌体表达目的蛋白
• 4.2.5.2 包涵体蛋白的提取
• 4.2.5.3 包涵体蛋白的洗涤与溶解
• 4.2.5.4 包涵体的纯化
• 4.2.5.5 包涵体蛋白的复性
• 4.2.5.6 根据考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
• 4.2.5.7 MTG 酶活测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 重组MTG 的表达分布
• 4.3.2 镍柱纯化重组 MTG 的 SDS-DAGE 结果
• 4.3.3 柱上复性重组 MTG 的 SDS-PAGE 结果
• 4.3.4 透析复性重组 MTG 的 SDS-PAGE 结果
• 4.3.5 蛋白质含量的测定
• 4.3.6 酶活的测定
• 4.4 本章小结
• 第五章 探索重组 MTG 的可溶性表达
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 主要试剂与仪器
• 5.2.3 实验步骤
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 乳糖浓度的确定
• 5.3.2 乳糖诱导时间的确定
• 5.3.3 低温诱导
• 5.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 A
• 附录 B
• 致谢
• 攻读学位期间所发表的学术论文目录