天祝白牦牛、岷县黑裘皮羊成纤维细胞库的构建

论文摘要

本论文选取了天祝白牦牛、岷县黑裘皮羊这两种国家级畜禽遗传资源保护品种作为研究对象,采用胰蛋白酶热消化法,分别构建这两种动物的多种组织的成纤维细胞库,并对其生长曲线、倍增时间、染色体核型、同工酶、微生物污染以及转化表达外源基因等特性进行研究,旨在成功地建立其成纤维细胞库,从细胞水平上对优良地方保护品种的遗传资源进行有效保存和利用,并为其它动物遗传资源保存提供可行的方法借鉴,同时所建的细胞库还可为胚胎干细胞研究、转基因工程、克隆等细胞分子生物学研究提供宝贵材料。天祝白牦牛保存样本28个,冻存细胞472支;岷县黑裘皮羊保存样本23个,冻存细胞290支,试验结果如下:1、培养细胞的形态均为典型的成纤维型细胞,绝大部分呈梭形或不规则三角形,细胞生长时呈放射状、火焰状或旋涡状走势,细胞增殖快,生长旺盛。2、绘制的细胞生长曲线显示,复苏细胞生长状况很好,生长曲线均呈“S”型,细胞每代生长均经历了潜伏期、指数生长期和停滞期,符合体外细胞生长规律。3、复苏后细胞活率均保持在90%以上,传代后生长状况与冻存前基本一致,细胞形态和生长速度没有明显变化,冻存细胞生物学特征稳定。4、微生物污染检测呈阴性,表明细胞未受到细菌、真菌、病毒及支原体污染。5、核型分析:天祝白牦牛体外培养的成纤维细胞正常染色体数为2n=60,包括29对常染色体和1对性染色体,常染色体29对为端着丝点染色体,性染色体X和Y染色体为近中着丝粒染色体,计数50个细胞染色体数目时,并对2n=60的进行统计,为74%,染色体中二倍体占主体;岷县黑裘皮羊体外培养的成纤维细胞正常染色体数为2n=54,包括26对常染色体和1对性染色体,常染色体有3对为中着丝点染色体,23对为端着丝点染色体,进行统计50个细胞染色体,2n=54占84%,表明所建细胞库的细胞稳定的二倍体细胞占主体,遗传性基本稳定。6、乳酸脱氢酶(LDH)同工酶是遗传成因性的同工酶,天祝白牦牛各种细胞的乳酸脱氢酶同工酶都显现五条区带,从“阳极”到“阴极”分别为LDH1,LDH2,LDH3 LDH4,LDH5,岷县黑裘皮羊跟中细胞都显现三条区带,从“阳极”到“阴极”分别为LDH1,LDH2,LDH3,通过LDH同工酶的区带分布和相对百分含量的比较表明不同品种的LDH同工酶含量不同,说明LDH同工酶具有明显的品种特异性;各品种细胞LDH同工酶酶谱表明,细胞遗传性能稳定,7、红色荧光质粒在成纤维细胞中的转化表达,试验表明成纤维细胞未发生与其它物种细胞的交叉污染和恶性转化,并能有效地转化表达外源基因,转染率可以作为衡量细胞活力的指标,同时转染成功的细胞也可以为结构基因组研究、后基因组研究、转基因研究提供大量的供体细胞。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1.1 动物遗传资源保护
• 1.1.1 动物遗传资源保护现状及意义
• 1.1.2 动物遗传资源保护的方法
• 1.1.3 动物遗传资源保护的发展前景
• 1.2 细胞培养及生物学特性研究
• 1.2.1 动物细胞培养技术的发展历史
• 1.2.2 动物细胞体外培养的特点和基本方法
• 1.2.3 细胞生物学特性研究
• 1.3 本研究意义
• 第二部分 试验材料
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂
• 2.3 其它
• 2.4 主要试剂的配制
• 2.4.1 MEM 培养液的配制
• 2.4.2 0.25%胰蛋白酶的配制
• 2.4.3 细胞冻存保护液的配制:
• 2.4.4 TSB 的配制
• 2.4.5 THIO 的配制
• 2.4.6 Hoechst 33258 的配制
• 2.4.7 秋水仙素的配制
• 2.4.8 Giemsa 贮存液的配制
• 2.4.9 同工酶分析所用试剂的配制
• 2.4.10 乳酸脱氢酶染色液配制
• 2.5 实验动物
• 2.5.1 岷县黑裘皮羊
• 2.5.2 天祝白牦牛
• 第三部分 两种动物成纤维细胞系的建立
• 3.1 过程与方法
• 3.1.1 标本采集及运输
• 3.1.2 原代细胞制备
• 3.1.3 细胞传代及纯化
• 3.1.4 细胞保存
• 3.1.5 细胞复苏
• 3.1.6 细胞生长特性观察
• 3.2 结果
• 3.2.1 细胞保存情况
• 3.2.2 细胞形态学观察结果
• 3.3 小结
• 第四部分 细胞生物学特性研究
• 4.1 过程与方法
• 4.1.1 细胞复苏活力检测
• 4.1.2 污染的检测
• 4.1.3 生长曲线的绘制
• 4.1.4 染色体核型分析
• 4.1.5 同工酶酶谱分析
• 4.1.6 荧光蛋白质粒转染表达
• 4.2 结果
• 4.2.1 细胞复苏活率检测结果
• 4.2.2 生长曲线和倍增时间
• 4.2.3 染色体核型分析结果
• 4.2.4 同工酶酶谱检测结果
• 4.2.5 荧光蛋白质粒转染表达结果
• 4.2.6 污染的检测
• 4.3 小结
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 附表
• 研究生在读期间科研与获奖情况
• 致谢