天蓝色链霉菌cvnA、sarA及rrdA基因功能的初步研究

论文摘要

第一部分天蓝色链霉菌A3（2）全基因组序列于2002年完成,在其中发现了13个非常保守的操纵子——conservon（cvn）。cvn由4-5个基因组成（cvnABCD或者cvnABCDE）,cvnA和cvnD分别编码一个跟组氨酸激酶具有较弱相似性的膜蛋白和一个类似真核G蛋白的GTP水解酶。我们在天蓝色链霉菌M145中成功构建了分别缺失13个cvnA基因的突变体,并在YBP培养基（添加了不同小分子营养物）上观察它们的表型变化,发现其中3个cvnA基因的缺失影响了菌丝发育和次生代谢。cvnA1突变体比野生型菌株发育更快,产孢更丰富,随着培养基内渗透压的升高,表型差异越来越明显。相对于野生型来说,cvnA1突变体放线紫红素（Act）和十一烷基灵菌红素（Red）的产量增加。在固体培养基YBP上,添加0.2M或更高浓度的NaCl、NaNO3、KCl或者KNO3后,cvnA1突变体能大量产生Act。cvnA2突变体在含甘氨酸的YBP培养基上生长发育比野生型要好。cvnA8突变体在含谷氨酰胺的培养基上产Act比野生型要早。生化实验证明CvnA1蛋白没有自磷酸化活性,但能结合并水解ATP。通过遗传互补实验我们发现CvnA1蛋白C端614个氨基酸对于上面所提到的表型不是必需的。进一步的RT-PCR实验发现cvnA1突变体中ramR、ramC、chpE、bldN,redD和redZ的转录水平比野生型显著升高了。这些结果表明CvnA1蛋白通过调控表面活化分子SapB、Chplins以及抗生素合成通路转录活化因子的mRNA水平来调控气生菌丝发育和次生代谢。第二部分链霉菌在整个生活周期中会经历一个形态分化和次生代谢的复杂过程。我们在天蓝色链霉菌M145中发现了一个在链霉菌中高度保守的新基因sarA（sco4069,sporulation and antibiotic production related gene）,该基因编码的蛋白除了跨膜结构域外没有任何已知功能结构域。跟野生型相比,sarA突变体孢子发育变快,Act和Red产量显著降低。RT-PCR分析表明SarA通过调控actⅡ-orf 4和redΖ的mRNA水平来调控抗生素的合成。第三部分链霉菌除了具有复杂的形态分化外,还能产生多种次生代谢产物特别是抗生素。为了能更深入地了解Red合成的信号调控通路,我们利用一种体内转座系统在天蓝色链霉菌中寻找参与Red合成调控的新基因。我们一共得到了25个不能产生Red的突变体,这些突变体Act的产量也同时受到了不同程度的影响。其中24个突变体的插入位点位于已知的Red生物合成基因簇中,另外一个突变体的插入位点位于rrdA（regulator of redD,sco1104）基因上游40bp。rrdA基因编码一个TetR家族的转录因子蛋白,在链霉菌中高度保守。与野生型相比,rrdA突变株中Red产量提高,Act产量下降,而在过表达rrdA基因的M145菌株中Red的产生受到抑制,Act的产量得到提高。RT-PCR结果表明RrdA通过调控redD的mRNA丰度来负调控Red的合成,而对Act合成特异转录调控因子actⅡ-orf4的转录没有影响,RrdA对Act的正调控作用很可能是因为Act和Red的合成存在底物竞争关系而形成的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要英文缩写
• 第一章 天蓝色链霉菌跨膜信号转导研究综述
• 一、机械感应通道蛋白
• 二、ABC转运蛋白
• 三、受体激酶
• R因子'>四、RsrA-抗σ^R因子
• 五、CvnA
• 六、结语
• 参考文献
• 第二章 天蓝色链霉菌cvnA基因功能的研究
• 第一节 前言
• 第二节 材料与方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论与展望
• 参考文献
• 第三章 天蓝色链霉菌sarA基因功能的研究
• 第一节 前言
• 第二节 材料与方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论与展望
• 参考文献
• 第四章 天蓝色链霉菌rrdA基因功能的研究
• 第一节 前言
• 第二节 材料与方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间论文发表情况和获奖情况