核酸信标配基的构建、合成、活性鉴定及检测技术的研究

论文摘要

随着科学技术发展,对分子检测技术的特异性、灵敏度有着更高要求。尤其是在临床应用和基础研究中,分子的定性和定量检测具有非常重要的意义。因此,探索新技术或改进现有技术以提高分子水平的精确定量,突破检测技术这一瓶颈,是目前科研工作的重中之重。本课题研究目的是构建一个具有配体识别和信号扩增能力的检测分子。在核酸信标配基的研究中,本文首次利用指数级富集配基进化技术（SELEX）筛选到小鼠IgG抗体Fc片段的特异性寡核苷酸配基,并进行了克隆、测序、序列分析及采用多种方法进行特异性鉴定,如:利用PCR进行阳性克隆筛选,dot-blot阳性配基筛选,高压液相色谱,凝胶阻滞等活性鉴定。共筛选到16株特异性配基克隆。同时,首次建立了一套较为完整的SELEX硝酸纤维素滤膜快速筛选方法。在此基础上,本文首次发明了核酸信标配基,完成设计、合成及活性鉴定。核酸信标配基是通过巢式-PCR方法,在配基的5’端连接一段荧光标记探针的靶（Beacon）序列,该序列是由两端两个引物和中间Taqman探针的互补序列构成,和靶分子具有对应性,即双链核酸信息标记的核酸信标配基。由于核酸信标是双链,不影响配基和靶分子（Fc片段）的结合,因此通过核酸信标来完成信息传导和信号放大功能。本文首次利用琼脂糖凝胶阻滞放射自显影和考马斯亮兰双显色方法,对核酸信标配基和抗体结合特异性进行鉴定。另外,本文首次建立两种方法对核酸信标配基进行功能鉴定:一种方法是核酸信标配基免疫-PCR方法（NBA-iPCR）,该方法是通过核酸信标配基与抗体结合形成信标配基-抗体复合物作为检测分子,再利用配基-抗体与抗原结合形成信标配基-抗体-抗原复合物,完成抗原信号到核酸信号的传递。通过实时定量-PCR检测证明,核酸信标配基具有传感和扩增能力。另一种方法是核酸信标配基-PCR方法（NBA-PCR）,该方法是将核酸信标配基作为检测分子,通过核酸信标配基和靶分子（抗体）结合形成配基-靶分子复合物,完成靶分子信号到核酸信号的传递。通过实时定量-PCR检测证明,核酸信标配基自身具有配基和配体识别能力和信号放大功能。综上所述:核酸信标配基完全具有适配体识别能力和信号储存、传递、放大功能。该分子将成为一种全新的、构建灵活、检测特异性强、灵敏度高、使用范围广的检测分子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 参考文献
• 第二章 小鼠IgG Fc 片段寡核苷酸配基的筛选、克隆、测序及分析
• 2.1. 前言
• 2.2. 材料与仪器
• 2.3. 方法
• 2.3.1. 文库的合成
• 2.3.2. 抗体IgG，Fc 片段特异寡核苷酸配基的筛选
• 2.3.3. 感受态细胞的制备及测试
• 2.3.4. 次级核酸文库的连接、转化
• 2.3.5. 小片段DNA 阳性克隆的筛选
• 2.3.6. 斑点杂交法（dot blot）--阳性配基的初筛选
• 2.3.7. 寡核苷酸配基的测序
• 2.3.8. 寡核苷酸配基的序列分析
• 2.4. 结果与讨论
• 2.4.1. 抗体IgG Fc 片段特异寡核苷酸配基的筛选
• 2.4.2. 寡核苷酸配基的重组结果
• 2.4.3. 阳性克隆的筛选结果
• 2.4.4. 斑点杂交法初步筛选特异性寡核苷酸配基结果
• 2.4.5. 特异性寡核苷酸配基测序结果
• 2.4.6. 特异性寡核苷酸配基序列分析结果
• 第三章 小鼠抗体IgG 的Fc 配基活性鉴定
• 3.1. 前言
• 3.2. 方法
• 3.2.1. 寡核苷酸配基特异性鉴定——斑点杂交法（dot blot）
• 3.2.2. 寡核苷酸配基特异性的检测分析
• 3.2.3. 寡核苷酸配基对不同小鼠I g G 亚型通用性的检测分析
• 3.2.4. 色普分离法对特异性寡核苷酸配基的鉴定
• 3.2.5. 琼脂糖凝胶阻滞方法
• 3.2.6. 聚丙稀酰胺凝胶凝胶阻滞方法
• 3.3. 结果与讨论
• 3.4. 结论
• 第四章 核酸信标配基分子的构建、克隆、测序及活性鉴定
• 4.1. 前言
• 4.2. 材料与仪器
• 4.3. 方法
• 4.3.1. 核酸信标配基分子的设计
• 4.3.2. 核酸信标配基分子的构建
• 4.3.3. 核酸信标配基分子的克隆、测序
• 4.3.4. 聚丙烯酰胺凝胶阻滞活性鉴定
• 4.4. 结果与讨论
• 4.4.1. 抗体IgG Fc 片段的核酸信标配基的构建
• 4.4.2. 信标配基连接转化结果
• 4.4.3. 阳性克隆测序结果
• 4.4.4. 核酸信标配基的活性鉴定
• 第五章 核酸信标配基检测方法的研究
• 5.1. 前言
• 5.2. 材料与仪器
• 5.3. 方法
• 5.3.1. 核酸信标配基介导的PCR原理
• 5.3.2. 核酸信标配基介导免疫-PCR检测方法的研究
• 5.3.3. 核酸信标配基介导PCR检测方法的研究
• 5.4. 结果与讨论
• 5.4.1. 核酸信标配基介导免疫－PCR检测（NBA-IPCR）
• 5.4.2. 核酸信标配基介导PCR检测（NBA-PCR）
• 5.5. 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢